Обнаружение прилипания бактерий к клеткам-хозяевам с помощью флуоресцентной визуализации

Аннотация

Источник: Yang, J., et al. Автоматизированное высокопроизводительное обнаружение прилипания бактерий к клеткам хозяина. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует анализ приверженности бактерий к культуре эпителиальных клеток, помеченный GFP, для изучения динамики взаимодействий хозяина и патогена с помощью визуализации на основе флуоресцентной микроскопии.

Протокол

1. Адгезия бактерий и окрашивание клеток хозяина

1. Сначала вымойте семенные монослои ячеек А549 три раза теплым 1х ПБС. Для каждой промывки добавляйте 100 μL 1x PBS в каждую лунку, аккуратно пипетируйте вверх и вниз три раза, утилизируйте 1x PBS или подождите 10 секунд после добавления, а затем пропылесосьте для удаления 1x PBS. Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, наложите на клетки 100 мкл желаемых концентраций бактериальной суспензии с различными MOI (0, 1, 10 и 100). Уменьшите количество бактерий при 200 x g в течение 10 минут и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 °C, 5%_CO2 в течение еще 1 ч.<бр/> заметка: В этом эксперименте каждое условие имело техническую тройку.
2. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым 1x PBS, как описано выше. Добавьте 100 мкл 4% формальдегида (в 1x PBS) в каждую лунку 96-луночных планшетов для фиксации клеток. Дайте пластинам постоять на льду в течение 15 минут, а затем смойте фиксирующий раствор с помощью 1x PBS три раза.
3. Чтобы окрашивать ядра, добавьте 50 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и инкубируйте его в течение 10 минут при RT. После инкубации промойте лунки три раза, используя 1х ПБС. Накройте инфицированные клетки A549 100 мкл 1x PBS во избежание высыхания. Перейдите к следующему этапу или храните тарелку при температуре 4 °C до 2 дней в темноте.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x PBS	ВВР	45001-130
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Термо Фишер	No 62248	Краситель для окрашивания клеток хозяина
96-луночный планшет	Корнинг	No 3882	Половина площади колодец, ровное чистое дно
Ячейки А549	АТКС	ССЛ 185	Клеточная линия млекопитающих
центрифуга	Эппендорф	5810Р
OD600 DiluPhotometer	ИМПЛЕМЕНТАЦИЯ
Типичный соевый бульон	Гроуклеоттинги	МБПЭ-4040
F-12k средний	АТКС	302004	Среда для культивирования клеток A549
Фетальная бычья сыворотка	Корнинг	35-016-СВ