Метод визуализации для изучения реакции кальция в клетках, инфицированных бактериями

Аннотация

Источник: Smail, Y., et al. Imaging Ca⁺ Responses during Shigella Infection of Epiтелиal Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод обнаружения локального и глобального ответа ионов кальция на шигеллу-инфекцию эпителиальных клеток человека. Шигелла проникает в клетки-хозяева и высвобождает эффекторы инвазии, влияя на внутриклеточный уровень кальция. Амплитуда и частота локального и глобального цитозольного кальция изучаются с помощью флуоресцентного индикатора.

Протокол

1. Подготовка

1. Бактериальный препарат
   1. Поместите бактерии — штамм Shigella дикого типа, экспрессирующий адгезин AfaE (M90T-AfaE) — на агаровую пластину триптиказы сои (TCS), содержащую 0,01% конголезского красного (CR), и инкубируйте их в течение 18 часов при 37 °C.
      заметка: Для повышения воспроизводимости пластины Shigella, полученные на шаге 1.1.1, хранят при температуре 4 °C и используют в течение недели, поскольку все колонии на среде CR со временем становятся красными.
   2. Инокулируйте бульон TCS перед культурой, выбрав 3 красные колонии из пластин с полосами.
      заметка: Инокуляция с 3 колониями проводится для ограничения вероятности выбора одного клона, вирулентная плазмида которого подверглась генетической рекомбинации.
   3. Выращивайте жидкие бактериальные культуры в встряхивающем инкубаторе в течение 16 ч при 37 °C при 200 об/мин. Добавьте ампициллин в конечной концентрации 75 мг/мл. Концентрации антибиотиков не должны превышать минимальную ингибиторную концентрацию в 3 раза, так как избыток антибиотика может привести к потере плазмиды большой вирулентности.
      заметка: Поддержание вирулентности плазмиды Shigella должно быть проверено путем нанесения бактериальных культур на планшеты CR с добавлением соответствующих концентраций антибиотиков. Наличие белых колоний указывает на потерю плазмид.
   4. Инокулируйте культуру TCS с бактериальной предварительной культурой в соотношении 1:100. Инкубируйте его при температуре 37 °C в встряхивающем инкубаторе в течение 2 ч при 200 об/мин. Убедитесь, что оптическая плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр_{600 нм)} составляет 0,2 - 0,4.
   5. Центрифугируйте бактериальную культуру в течение 2 мин при 13 000 x g при 21 °C и ресуспендируйте гранулу в эквивалентном объеме ЭМ-среды (120 мМ NaCl, 7 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl₂, 0,8 мМ MgCl₂, 5 мМ глюкозы и 25 мМ HEPES, pH = 7,3).
   6. Разведите бактериальную суспензию в ЭМ-буфере при конечном наружном диаметре_{600 нм} 0,1 и используйте ее немедленно или храните при температуре 21 °C и используйте в течение следующих 60 минут.
2. Подготовка клеток
   1. Культивируют клетки HeLa в DMEM с 1 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и выращивают их при 37 °C с 10%_CO2. Выращивайте TC-7, выращенный в DMEM с 4,5 г/л глюкозы, содержащей 10% FCS и заменимые аминокислоты, в инкубаторе при температуре 37 °C, содержащем 10%_CO2.
   2. Для поддержания клеток регулярно разделяйте клетки, чтобы избежать ингибирования контакта роста, связанного с конфлюентными состояниями; это имеет решающее значение для высокой эффективности загрузки/трансфекции зонда Ca²⁺.
   3. Пластинчатые клетки HeLa на стерильные круглые покровные стекла диаметром 25 мм в 6-луночных планшетах с плотностью 3 х 10 5 клеток/лунку за день до эксперимента для клеток HeLa.
   4. Для клеток TC-7 трипсинизировать и подсчитать клетки. Высейте их в соотношении 4 x 10⁵ клеток/лунку и инкубируйте в течение 5-7 дней при 37 °C в инкубаторе с 10%_CO2 перед экспериментами, чтобы обеспечить поляризацию.
      1. Обновляйте среду для культивирования клеток каждый день до дня проведения эксперимента.
         заметка: В качестве альтернативы колодцам, содержащим покровные колодцы, также могут использоваться одноразовые камеры со стеклянным дном диаметром 35 мм. Если используются последние, то контроля температуры с помощью нагреваемого предметного столика или объектива недостаточно, и требуется инкубационная камера с термостатом, установленная на предметном столике микроскопа.
3. В день эксперимента удалите среду и промойте клетки 3 раза 1 мл ЭМ среды при температуре 21 °C.
4. Загрузите в ячейки 3 мМ флуо-4/ацетоксиметиловый эфир (Fluo-4-AM) в ЭМ-буфер на 30 мин при 21 °C.
   заметка: В то время как загрузка субконфлюентных клеток HeLa не вызывает серьезных проблем, загрузка поляризованных клеток TC-7 часто неоднородна и плохо эффективна. Для этих клеток мы обнаружили, что эффективность загрузки повышается за счет добавления диспергирующего агента — плуроновой кислоты — в конечной концентрации 0,1% и ингибитора аниона-транспортера бромосульфофталеина в конечной концентрации 20 мкМ в ЭМ, содержащую флуо-4-АМ. Использование ратиометрических химических зондов или генетически кодированных FRET-зондов, требующих двойного захвата, несовместимо со скоростью сбора, необходимой для визуализации локальных ответов^Ca2+.
5. Промойте образцы 3 раза с помощью ЭМ-буфера и далее инкубируйте их в 1 мл ЭМ-буфера при 21 °C для гидролиза ЭМ-фрагмента. Используйте нагруженные элементы Fluo-4 немедленно или в течение следующих 90 минут (при температуре 21 °C).

2. Заражение и получение изображений локальных ответов Ca²⁺

1. Поместите покровное стекло с заряженными элементами Fluo-4 в камеру визуализации или камеру со стеклянным дном. Промойте образцы в камере визуализации или одноразовой камере со стеклянным дном 3 раза с ЭМ-буфером для удаления соединений, которые могут возникнуть в результате лизиса клеток. Добавьте 1 мл ЭМ буфера.
2. Поместите камеру на предметный столик с инвертированным флуоресцентным микроскопом, нагретый до 33 °C.
   заметка: Эта температура выбрана в качестве компромисса между оптимальными температурами, совместимыми с процессом инвазии шигеллы, и замедлением реакций Ca²⁺ для визуализации локальных реакций. Мы используем объектив с погружным маслом 63X (NA = 1,25), оснащенный кольцами фазового контраста.
3. Выберите поле для микроскопии и настройте параметры регистрации, включая время экспозиции и биннинг при необходимости, для оптимизации флуоресцентного сигнала Fluo-4.
   заметка: Основными проблемами локальной визуализации Ca²⁺ являются низкая амплитуда и малая продолжительность ответов, требующие регистрации не реже одного раза в 30 мс. Несколько коммерчески доступных устройств с обратной подсветкой и умножающей электроны зарядовой связи (EM-CCD) или комплементарных металлооксидных полупроводниковых камер (C-MOS) обладают необходимой чувствительностью для детектирования локальных откликов Ca²⁺ с помощью Fluo-4. Чувствительность обнаружения также является важным фактором для ограничения фотоповреждений или артефактов, таких как спонтанные реакции, связанные с флуоресцентным возбуждением Fluo-4 на высокой частоте. В данном случае светодиодное освещение с длиной волны 470 нм с фильтром полосового возбуждения 480 ± 40 нм, дихроичным фильтром 505 нм и полосовым излучением 527 ± 30 нм, используемым на 5% от его максимальной интенсивности, в сочетании с фильтром нейтральной плотности 1,0 были использованы для минимизации этих проблем в потоке наблюдений ограниченной продолжительности. В плановом порядке проводился анализ локальных сигналов Ca²+ пакетами по 120 с потоков. В условиях низкой освещенности фотообесцвечивание флуорофорами не наблюдалось во время сбора данных в течение 2 минут. Могут быть выполнены последовательные сборы данных на одном и том же образце при условии использования различных полей. Как правило, первый поток регистрации проводится на контрольном поле в отсутствие стимуляции бактериями, чтобы обеспечить отсутствие спонтанных реакций. Если наблюдаются спонтанные реакции, образцы промывают ЭМ-буфером до тех пор, пока реакции не исчезнут.
4. Чтобы добавить бактерии в образец, удалите 500 мкл ЭМ-буфера из камеры и добавьте 500 мкл бактериальной суспензии, приготовленной на шаге 1.1.6, для получения конечного наружного диаметра_{600 нм} 0,05, с соответствующей осторожностью, чтобы избежать смещения выбранного поля микроскопии; объемы обеспечивают надлежащее смешивание бактерий и однородное распределение бактерий по образцам клеток.
5. Проведите сбор после добавления бактерий. В качестве альтернативы можно провести сбор данных через 10 минут после присоединения бактерий, что соответствует времени, необходимому для осаждения бактерий на клетках в используемых условиях. В конце потока сбора данных получите фазово-контрастное изображение выбранного поля, чтобы визуализировать бактерии, контактирующие с клетками, и мембранные взъерошения, связанные с местами бактериальной инвазии.
6. Повторите процедуру получения изображений, как в шаге 2.5, с интервалами, которые зависят от продолжительности получения изображения, сохранения файлов и выбора нового поля, чтобы охватить весь процесс.
   Примечание: Для Shigella мы обнаружили, что потоки сбора данных каждые 5 минут в течение 20 минут, после 10-минутного осаждения бактерий, позволяют охватить большинство событий инвазии.
7. В конце процедуры сбора данных добавьте концентрацию 2 мкМ образцов иономицина Ca²⁺ ионофора для определения максимальной амплитуды сигналов Ca²⁺. Получение изображений каждые 3–5 с до стабилизации сигнала, обычно менее 10 минут.
8. Затем добавляют хелатор Ca²⁺ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N, N, N', N'-тетрауксусную кислоту (EGTA) в конечной концентрации 10 мМ для определения сигнала флуоресценции в отсутствие Ca²⁺. Получение изображений каждые 3 - 5 с до стабилизации сигнала, обычно менее 10 мин.<бр/> заметка: Из-за относительно медленной динамики глобальных вариаций Ca²⁺ выполняйте эти съемки каждые 3 - 5 с (не в потоковом режиме), что позволяет визуализировать Ca²⁺ на одном и том же микроскопическом поле во время последующих обработок.

3. Анализ

1. Экспрессируйте цитозольные вариации Ca²⁺ с течением времени в процентах от ΔF/F0, где ΔF представляет собой изменение средней интенсивности флуоресценции исследуемой области (ROI), а F0 — исходную флуоресценцию в том же ROI, к которому вычитается нерелевантная область поля, лишенная клеток.
   1. Удалите уровни базальной флуоресценции для каждой клетки в различных полях, соответствующие базовым уровням; эти уровни могут быть однозначно определены благодаря низкой частоте и относительно короткой продолжительности локальных ответов^Ca2+ в данном потоке><. Примечание: Количественно оцените поразительные особенности ответов, связанных с заданными вопросами и изученной патогенной моделью. Классически для анализа сигналов Ca²⁺ учитываются различные параметры, в том числе частота ячеек, демонстрирующих локальные или глобальные ответы Ca²⁺, а также продолжительность, амплитуда и частота этих откликов. В случае шигеллы и местных реакций еще одним важным аспектом анализа является пространственная связь реакций с местами бактериальной инвазии.
2. Чтобы количественно оценить процент чувствительных ячеек, демонстрирующих глобальные или локальные реакции, нарисуйте ROI в ячейках во временных рядах, соответствующих изменениям интенсивности Fluo-4.
   1. Установите строгие параметры для идентификации локальных ответов Ca²⁺, такие как амплитуда в три раза выше фоновых вариаций средней интенсивности флуоресцентной ячейки или продолжительность не менее 200 мс, чтобы избежать получения ложноположительных результатов.
      заметка: Как правило, даже небольшие локальные отклики Ca²⁺ можно отличить от любого фонового шума по их профилю. ROI должен быть достаточно большим, чтобы интегрировать достаточное количество флуоресцентных сигналов, чтобы можно было обнаруживать локальные вариации. В зависимости от интенсивности обнаружения Fluo-4 эти ROI могут соответствовать окружностям диаметром от 2 до 5 мМ.
   2. Измерьте изменения средней интенсивности флуоресценции Fluo-4 в 2 областях в определенной области одной и той же клетки, чтобы определить, являются ли реакции локальными или глобальными><. заметка: Анализ большого количества клеток облегчается использованием программного обеспечения для визуализации, позволяющего отображать на экране в режиме реального времени изменения средней интенсивности флуоресценции для выбранных областей. Коммерчески доступное программное обеспечение для визуализации имеет такую опцию, но это также можно сделать с помощью бесплатного программного обеспечения Icy, используя плагин ROI Intensity Evolution.
   3. Определите процент клеток, показывающих локальные реакции.
      заметка: Этот процент рассчитывается из общего числа клеток, проанализированных в поле микроскопии, которое должно быть достаточным для подтверждения статистической значимости с помощью непараметрического теста.
   4. Определите продолжительность локальных ответов.
      заметка: Локальные реакции Ca²⁺ можно дополнительно различать в зависимости от диапазонов их длительности (т.е. менее 500 мс, от 5 до 10 с или более 10 с) и их связи с местами инвазии шигеллы.
3. Количественно оцените амплитуду ответов. Во-первых, откалибруйте максимальный уровень^Ca2+ и фоновый уровень клеток, определенный на шаге 2.1.7. Поскольку нагрузка Fluo-4 может варьироваться для каждой ячейки, выполните эти определения для отдельных ячеек в полевых условиях.
   1. Выразите амплитуду ответов в виде относительного процента от максимального ответа.
   2. Выполните статистическое тестирование с помощью теста на нормальность, за которым следует параметрический тест для анализа потенциальных различий в амплитуде откликов между образцами.
   3. Определить ассоциацию этих реакций относительно сайтов бактериальной инвазии по их соответствующей локализации на индуцированных бактериями мембранных оборках, визуализированных на соответствующих фазовых контрастных изображениях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флуо-4 АМ	Инвитроген	Ф14201
Версия Metamorph 7.7	Универсальная визуализация
Система подсветки CoolLED pE-2	Роупер Сайентифик
Микротарелка 35 мм, высокая	ИБИДИ	81156
Триптиказ соевый бульон (TCS)	Термофишер	В11768
Агар TCS	Термофишер	В11043
Конго красный	Сигма-Олдрич	75768
М90Т-АфаЕ	Sun et al. 2017		Shigella flexneri серотипа V. экспрессирующая адгезин AfaE
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		Изогенный мутантный штамм ipgD, экспрессирующий адгезин AfaE