Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка панлейкоцитов
- Возьмите 1 мл периферической крови у здорового донора (или пациента) в гепаринизированный шприц. Убедитесь, что у вас есть одобрение ответственного комитета по этике на донорство крови.
- Смешайте 1 мл периферической крови человека с 30 мл буфера для лизиса ACK (150 мл NH4Cl, 1 мМ KHCO3 и 0,1 мМ ЭДТА, pH 7,0) в пробирке объемом 50 мл и инкубируйте в течение 8 минут при комнатной температуре.
- Заполните пробирки PBS и центрифугируйте при 300 x g в течение 6 мин. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 30 мл буфера для лизиса ACK.
- Повторяйте шаги 1.2 и 1.3 до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Наконец, промойте клетки в PBS, центрифугируйте при 300 x g в течение 6 мин при комнатной температуре и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 60 минут.
2. Загрузка ячеек Raji с помощью SEB
- Приготовьте две пробирки Falcon объемом 15 мл с 1,5 x 106 ячеек Raji в каждой пробирке. Раскрутите ячейки (300 х г в течение 6 минут при комнатной температуре) и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клетки в остаточной среде (около 50–100 мкл), добавьте 1,9 мкл (1,9 мкг) SEB и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавьте 5 мл питательной среды, открутите клетки (300 x g в течение 6 мин при комнатной температуре) и ресуспендируйте гранулу в культуральной среде (RPMI1640 + 10% FCS) при плотности 1 x 106 клеток/мл.
3. Индукция иммунных синапсов и протокол окрашивания
- Пипетка 500 мкл препарата SEB-загруженных ячеек Raji в пробирку FACS и 500 мкл препарата выгруженных клеток Raji в другую пробирку FACS. Добавьте 650 μL пан-лейкоцитов в каждую пробирку и подавите клетки (300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре). Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 150 мкл питательной среды (RPMI1640 + 10% FCS). Инкубировать при температуре 37 °C (обычно в течение 45 минут).
Осторожно нанесите - вихрь на клетки (10 с при 1000 об/мин) и добавьте 1,5 мл параформальдегида (1,5%) во время вихря, чтобы зафиксировать клетки. Остановите фиксацию, добавив 1 мл PBS + 1% BSA. Гранулировать клетки (300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре) и повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл PBS + 1% BSA после инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Гранулы (300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре) и ресуспендировать клетки в 100 мкл PBS + 1% БСА + 0,1% сапонин в течение 15 мин при комнатной температуре для проникновения в клетки (96-луночный планшет, U-образная форма).
- Промойте клетки в PBS + 1% BSA + 0,1% сапонин центрифугированием (300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре) и ресуспендируйте клеточную гранулу в 50 μL PBS + 1% BSA + 0,1% сапонин, содержащие меченые флуорофорами антитела или соединения (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) и DAPI (1:3,000)).
- Инкубировать клетки при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Промыть клетки 3 раза, добавив 1 мл PBS + 1% BSA + 0,1% сапонина. Центрифуга при 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в 60 мкл PBS для визуализационной проточной цитометрии.
4. Получение изображений с помощью проточного цитометра
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура получения изображений и анализ данных основаны на визуализационной проточной цитометрии с использованием таких программ, как imagestream (IS100), INSPIRE и IDEAS. Тем не менее, можно использовать и другие проточные цитометры и программное обеспечение для анализа.
- Откройте программное обеспечение для анализа на компьютере, подключенном к проточному цитометру для визуализации, и нажмите «Инициализировать жидкость» в меню «Инструмент». Нанесите бусины на нужный порт, когда вам будет предложено это сделать.
- Загрузите шаблон по умолчанию из меню «Файл» и нажмите «Выполнить/Настроить». Выберите «Бусины» в выпадающем меню «Вид».
- Отрегулируйте яркопольный осветитель, нажав на кнопку «Установить интенсивность», если указанное значение ниже 200.
- Запустите процедуру калибровки и тестирования на вкладке «Помощь», нажав «Начать все».
- Нажмите «Сброс/Заблокировать/Загрузить» и примените образцы в левом порту, когда появится соответствующий запрос. После загрузки клеток в проточный цитометр откройте классификатор клеток и отрегулируйте значения следующим образом: верхний предел пиковой интенсивности на уровне 1022 для каждого канала, нижний предел пиковой интенсивности на уровне 50 для канала 2 (DAPI) и канала 5 (CD3-Pe-TxR), нижний предел области на уровне 50 для канала 1 (боковое рассеяние) и верхний предел на уровне 1500.
- Измените мощность возбуждающего лазера на 405 нм (15 мВт), 488 нм (200 мВт) и 647 нм (90 мВт) на вкладке Настройка.
- Переключите выпадающее меню Вид между Ячейками и Бусинами, чтобы оценить классификатор ячеек и настройки мощности лазера.
заметка: Убедитесь, что все ячейки и пары клеток найдены в виде клеток, а скопления клеток, мусор и изображения с насыщенными пикселями находятся в виде мусора, изменив классификаторы клеток и/или мощности возбуждающего лазера.
- Задайте имя образца и количество изображений для получения (15 000–25 000 для образцов и 500 для компенсационных элементов управления) на вкладке Настройка. Нажмите кнопку Выполнить/Настроить, чтобы начать сбор.
