ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы подготовки среды и культивирования клеток проводятся в асептических условиях с использованием шкафа биобезопасности с ламинарным потоком. Все описанные этапы инкубации культур проводятся с использованием инкубатора, предназначенного для поддержания атмосферы 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.
1. Клеточная культура
- Приготовление питательной среды
- Для MSC (мезенхимальных стволовых клеток) и LADMAC (макрофагов, полученных из костного мозга мыши; это происходит от имен исследователей, создавших клеточную линию: Laskin, Dower и Malech), добавьте 50 мл FBS и 5 мл 100-кратной смеси антибиотиков/антимикотиков к 500 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы (модифицированная среда Dulbecco Eagle
).
- Для макрофагов (MΦ) добавьте 50 мл FBS, 100 мл кондиционной среды LADMAC (приготовленной в соответствии с инструкциями раздела 1.2) и 5 мл 100-кратной смеси антибиотиков к 500 мл DMEM.
заметка: Клетки LADMAC продуцируют колониестимулирующий фактор (CSF-1), необходимый для поддержания роста клеток MΦ.
- Пропагандируйте клетки при подготовке к кокультуре
- Для посева клеток MSC и MΦ из замороженного сырья уравновесить 9 мл соответствующей питательной среды, приготовленной в разделе 1.1, в каждой из четырех обработанных 100 мм клеточных культур для каждого типа клеток и поместить в инкубатор для клеточных культур на 15 мин.
- Тем временем быстро разморозьте аликвоты из10-6 замороженных клеток, инкубируя их на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2-3 минут или до полного оттаивания. Затем добавьте размороженные клетки MSC в 9 мл свежей питательной среды MSC и добавьте размороженные клетки MΦ в 9 мл свежей питательной среды MΦ в 15 или 50 мл стерильных конических пробирок и центрифугируйте при 125 x g в роторе с качающимся ведром в течение 5 минут.
- Отсадите или сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 4 мл соответствующей свежей питательной среды, осторожно пипетируя вверх и вниз. Добавьте по 1 мл клеточной суспензии в каждую из четырех 100-миллиметровых чашек для каждого типа клеток, которые были уравновешены на шаге 1.2.1.
- Верните посуду с клетками в инкубатор. Меняйте среду каждые 2-3 дня до 70%-80% слияния.
2. Семена MSC в экспериментальных чашках, День 1
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед загрузкой MSC, разработайте экспериментальную схему из 96-луночных планшетов для флуоресцентной спектрофотометрии и предметное стекло камеры для динамической визуализации. Для 96-луночного планшета фланкируйте экспериментальные лунки лунками, содержащими клетки, но не используйте их в анализе. Отметьте не менее четырех лунок, которые будут использоваться для заготовки реагента (RBL). В Таблице 1 приведен пример шаблона для 96 лунок, а в Таблице 2 приведен пример шаблона для 4-луночной камеры. Рекомендуются черные или белые 96-луночные планшеты с прозрачным дном. Оптимальным является предметное стекло из боросиликатного стекла диаметром 1,5 мм, но количество камер может быть скорректировано в зависимости от дизайна исследования. Краткая блок-схема приведенных ниже методов представлена на рисунке 1.
- При конфлюенции 70%-80% аспирируйте питательную среду из культур в 100-миллиметровых чашках и добавьте 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для выделения MSC.
- Отсадите PBS, добавьте 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и поместите его в инкубатор для культур на 3-5 минут.
- Через 3 мин проверьте отслойку клеток с помощью инвертированного микроскопа. Если ячейки отделены, перейдите к следующему шагу; Если нет, продолжайте инкубацию еще 1-2 минуты. Не следует инкубировать дольше 5-6 минут.
- Добавьте 5 мл свежей питательной среды в посуду с отделенными ячейками. Промойте чашку с помощью смеси трипсин/среда и соберите клетки в чистую стерильную коническую пробирку объемом 50 мл с помощью стерильной серологической пипетки.
- Центрифуга в течение 5 мин при 125 x g. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл свежей питательной среды, осторожно пипетируя вверх и вниз.
- Чтобы подсчитать клетки, добавьте 10 мкл клеточной суспензии в 30 мкл 0,4% раствора трипанового синего в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем пипеткой нанесите 10 мкл смеси под покровную камеру счетной камеры гемоцитометра.
- Используя инвертированный или светлопольный микроскоп с 10-кратным объективом, подсчитайте неокрашенные (жизнеспособные) клетки в четырех квадратах размером 1 мм2 квадрата. Рассчитайте количество клеток по формуле: клетки/мл = количество клеток/# 1 мм2 квадрата х коэффициент разведения х10 4,<бр />
заметка: Для этого примера количество квадратов 1мм2 считается равным четырем, а коэффициент разбавления равен 4.
- Используйте уравнение C1V1 = C2V2 для расчета и приготовления суспензии 1 x 105 клеток/мл. Приготовьте 1 мл суспензии клеток/мл для каждой колонны 96-луночного планшета, который должен быть заполнен, и 0,75 мл для каждой камеры 4-луночного предметного стекла, которое должно быть заполнено в соответствии с конструкцией планшета.
заметка: C1 = количество клеток, V1 = то, что вычисляется, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 мл.
- Определите V1 и вычтите его из желаемых 5,50 мл от общего объема, чтобы определить объем свежей среды, необходимой для приготовления суспензии. Добавьте объем клеток (V1) из исходной суспензии к объему свежей среды, что в сумме составит 5,50 мл с концентрацией 1 x 105 клеток/мл.
- Добавьте 100 мкл суспензии 1 x 105 клеток/мл в каждую лунку 96-луночного планшета в соответствии с конструкцией планшета с помощью многоканального микропипеттора и 530 мкл в каждую из лунок предметного стекла камеры с помощью микропипетки в соответствии с конструкцией планшета. Инкубировать в течение ночи.
заметка: Для этого эксперимента МСК нанесены в столбцы 1, 2, 3 и 6 96-луночного планшета (Таблица 1) и в лунки 1 и 2 4-луночного предметного стекла (Таблица 2). Поэтому готовят не менее 5,50 мл суспензии 1 x 105 клеток/мл. MΦ при 80% слиянии обрабатывают медиаторами воспаления в тот же день, когда МСК засеиваются в экспериментальные планшеты.
3. Изолируйте MΦ и подготовьте сокультуры, День 2
- Удалите активационную среду из клеток MΦ и замените ее 5 мл свежей питательной среды. Аккуратно соскребите клеточный подъемник и соберите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Подсчитайте клетки с помощью исключения трипанового синего и гемоцитометрии, как описано для МСК в шагах 2.6-2.7.
- Используя уравнение на шагах 2.8-2.9, приготовьте две отдельные суспензии 2 x 105 клеток/мл, одну с клетками из контрольной группы, а другую с клетками из обработанных культур MΦ.
заметка: Приготовьте 1 мл суспензии клеток/мл для каждой колонны 96-луночного планшета, который должен быть заполнен, и 0,75 мл для каждой камеры 4-луночного предметного стекла, которое должно быть заполнено в соответствии с конструкцией планшета.
- Осторожно отсасывайте среду из экспериментальных лунок 96-луночного планшета, содержащего МСК. С помощью многоканальной микропипетки добавьте 100 мкл обработанных и контрольных суспензий клеток MΦ в соответствующие экспериментальные лунки с МСК и без них в соответствии с конструкцией планшета. Высиживайте в течение ночи.
- Осторожно отсадите среду из 4-луночного предметного стекла, содержащего МСК, и с помощью микропипетки добавьте 530 мкл суспензии клеток MΦ в соответствующие лунки в соответствии с конструкцией. Высиживайте в течение ночи.
4. Анализ фагоцитоза, кинетическое флуоресцентное чтение 96-луночного планшета, день 3
- Задание параметров анализа
- В день проведения анализа включите считыватель флуоресцентных пластин и компьютером установите температуру на системе на 37 °C.
- Откройте программное обеспечение System Pro и проверьте значок прибора в левом верхнем углу, чтобы определить, подключен ли прибор к компьютеру. Если виден красный круг с линией, нажмите на иконку инструмента и выберите инструмент во всплывающем окне для подключения.
- Выберите «Новый эксперимент», чтобы получить доступ к всплывающему окну «Помощник по настройке пластин». В меню Помощник по настройке пластин выберите пункт Настройка параметров сбора данных.
- Выберите Monochromator в меню настроек для оптической конфигурации. Выберите FL (флуоресценция) для режима чтения и Kinetic для типа чтения.
- В том же окне конфигураций в разделе Категория нажмите на Длины волн, а затем установите ширину полосы 9 нм для возбуждения и 15 нм для излучения.
- Установите количество пар длин волн равным 1. Установите длины волн LM1 на 510 нм для возбуждения и на 540 нм для излучения.
- Продолжайте движение по категориям и выберите Тип пластины далее. Выберите вариант, соответствующий типу используемой пластины.
заметка: Важно, чтобы выбор соответствовал типу пластины. Высота считывания устанавливается системой в соответствии с выбранным вариантом.
- Затем выберите Read Area (Область чтения) и выделите область 96-луночного планшета, включенного в экспериментальный дизайн.
- Выберите ФЭУ и оптику, установите для параметра Усиление ФЭУ значение Высокий и Количество вспышек на чтение на 6. Установите флажок рядом с пунктом «Чтение снизу», если вы используете пластину с прозрачным дном.
- Выберите Время и установите 10-минутные интервалы в течение 70-минутного периода.
- Выберите «Встряхнуть», установите флажок «Перед первым чтением» и установите его на 5 секунд. Установите флажок «Между чтениями» и установите его на 3 секунды. Установите интенсивность встряхивания для обоих значений Низкая и Линейная.
- Закройте окно. Когда появится всплывающее окно Помощник по настройке пластин, выберите Настроить раскладку пластин. Выделите лунки BL конструкции пластины и нажмите на кнопку «Заготовка пластины».
- Выделите каждую из экспериментальных строк, нажмите кнопку Добавить, присвойте группе имя и выберите цвет.
- В разделе "Параметры назначения" под конструкцией пластины выберите "Серия", а затем определите серию в окне и нажмите кнопку "OK". Повторите для каждой группы.
- Приготовьте суспензию зимозана
- Дождавшись, пока температура системы достигнет 37 °C, ресуспендируйте 1 мг частиц зимозана в 5 мл среды визуализации живых клеток.
- Добавьте 1 мл среды для визуализации живых клеток во флакон, содержащий частицы, и соберите их в стеклянную пробирку для культивирования. Промойте флакон еще 1 мл раствора для визуализации и переложите его в ту же стеклянную пробирку, чтобы убедиться, что все частицы перенесены. Добавьте 3 мл дополнительного раствора для визуализации, чтобы получить суспензию частиц 0,2 мг/мл.
- Вихрь с быстрыми импульсами в течение 30-60 с. Затем с помощью ультразвукового датчика произведите ультразвуковую обработку 60 быстрыми импульсами.
заметка: Очень важно создать однородную суспензию частиц и не дать суспензии постоять слишком долго перед добавлением в экспериментальные лунки. Комкование повторяется быстро. Может потребоваться оптимизация плотности частиц на клетку в зависимости от источника, обработки и плотности используемого MΦ. В представленных исследованиях использовались конъюгированные частицы зимозана. Тем не менее, также доступны конъюгированные E. coli и S. aureus.
- Добавьте зимозан и прочитайте табличку
- Отсадите среду из экспериментальных лунок и промойте 1 раз 100 мкл раствора для визуализации живых клеток. Также промойте лунки RBL раствором для визуализации живых клеток.
- Отсадите раствор для визуализации живых клеток из экспериментальной лунки и лунки RBL и замените его 100 мкл суспензии частиц зимозана.
- Откройте лоток для тарелок флуоресцентного считывателя с помощью интерфейса сенсорной панели. Установите тарелку без крышки в лоток с отверстием А1 в верхнем левом углу. Закройте лоток с помощью тачпада и нажмите на зеленую кнопку «Читать» в верхнем меню.
- Когда чтение будет завершено, сохраните файл в соответствующую папку и экспортируйте данные в формате электронной таблицы, нажав на «Файл» и выбрав «Экспорт».
- Рассчитайте среднее значение относительной флуоресценции ± SEM для каждой группы реплик в каждый момент времени (10 мин, 20 мин, 30 мин и т. д.) в таблице (Дополнительный файл 1) и перенесите данные в программное обеспечение для построения графиков.
- Используйте формат линейного графика для представления данных и примените двустороннюю ANOVA (время x лечение/MSC как факторы), а затем тест множественных сравнений Тьюки для определения различий между отдельными группами><.
заметка: Пока идет чтение 96-луночного планшета, подготовьте планшет с динамическим изображением для получения покадрового изображения. Убедитесь, что динамическая визуализация продолжается с анализом одной экспериментальной скважины за раз.
Таблица 1: Пример конструкции 96-луночного планшета. CBL - Заготовка ячеек; MSC - сеяный день 1; MΦ+ обработанный и MΦ необработанный посев 2-й день; Заготовка реагента RBL добавлена на 3-й день анализа.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| a | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| В | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| С | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| Г | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| Е | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| Ф | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| Г | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
| Ч | КБЛ | МСК/МΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | КБЛ | РБЛ |
Таблица 2: Пример конструкции 4-луночной камеры. MSC - покрытие день 1; MΦ+ обработанный и MΦ необработанный гальванический день 2.
