Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выращивание и приготовление бактериального инокулята
- Разморозьте запасы глицерина Helicobacter pylori (H. pylori) или H. felis от -80 °C и субкультуру на агаре лошадиной крови (HBA), включающую: основание агара крови No2 (см. Таблицу материалов); модифицированную «селективную добавку антибиотика Скирроу» (состоящую из ванкомицина, 10 мкг/мл; полимиксина В, 25 нг/мл; триметоприм, 5 мкг/мл; амфотерицин В, 2,5 мкг/мл); и 5–10% (v/v) лошадиной крови. Бактерии хорошо растут в микроаэробных условиях в анаэробных банках объемом 2,5 или 3,5 л, содержащих соответствующие газовые пакеты (см. Таблицу материалов), при температуре 37 °C.
Примечание: Штаммы H. pylori, выращенные в этих условиях, должны быть субкультурированы после 1–1,5 дней инкубации, тогда как для H. felis, как правило, требуется не менее 2 дней инкубации. Подходящая культура и среда хранения были подробно описаны ранее.
- Приготовьте бактериальный инокулят для мышиной инфекции из культур ранней и средней логарифмической фазы. Аккуратно соберите бактерии с агаровых пластин, наполнив каждую пластину 1–2 мл бульона для инфузии мозга и сердца (BHI). Аспиратные суспензии из планшетов с пипетками Пастера.
- В качестве альтернативы можно приготовить инокулю из бактерий Helicobacter, размноженных в бульоне BHI в течение 16–18 ч. В этом случае соберите бактерии с помощью низкоскоростного центрифугирования при давлении 2 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Оцените жизнеспособность и подвижность бактерий путем изучения препаратов влажного монтирования под фазово-контрастной микроскопией (объектив 100X). Приготовьте влажные крепления, суспензируя полную петлю бактерий в 10–20 мкл капли бульона BHI на предметном стекле для стеклянного микроскопа. В случае H. felis, которая является гораздо более крупной бактерией, чем H. pylori, используйте гемоцитометр для точного подсчета количества жизнеспособных бактерий. Подтвердите чистоту культуры, выполнив окрашивание по Граму.
заметка: Используйте инокуляцию H. pylori только в том случае, если большинство бактерий имеют бациллярную или спиралевидную форму (морфология может варьироваться в зависимости от штамма).Не используйте инокуляцию, если большинство бактерий имеют коккоидную морфологию, так как эти формы нежизнеспособны и не приведут к развитию инфекции у мышей.
- Оцените количество бактерий в посевном материале, подсчитав с помощью фазово-контрастной микроскопии приблизительное количество бактерий на поле (объектив 100X) и используя следующее руководство: 1 бактерия на поле = примерно 106 колониеобразующих единиц (КОЕ) Helicobacter/мл; 10 бактерий на поле = примерно 107 КОЕ/мл; 100 бактерий на поле = примерно 108 КОЕ/мл, и так далее.
- При использовании гемоцитометра рассчитывайте КОЕ/мл по следующей формуле:
КОЕ/мл = (среднее количество бактерий в поле 4 x 4) x (коэффициент разбавления) x (104).
- При необходимости отрегулируйте плотность бактериальных клеток инокулюма примерно до 107–10 8 КОЕ/мл путем разведения в бульоне BHI.
- Чтобы обеспечить максимальную жизнеспособность бактерий, используйте инокуляцию для внутрижелудочного зондирования как можно скорее после приготовления.
- Всегда подтверждайте плотность и жизнеспособность клеток H. pylori, выполняя подсчет жизнеспособных инокулятов сразу после процедуры зондирования (см. ниже). Для H. felis, это не всегда возможно, так как он обычно не образует изолированных колоний на питательных средах. Количество жизнеспособных Helicobacters в инокуляте не может быть определено только с помощью оптического измерения плотности (A600), поскольку этот метод не делает различий между жизнеспособными (т.е. бациллярными/спиральными/спиралевидными) и нежизнеспособными (т.е. коккоидными) бактериями.
- Используйте значения оптической плотности в качестве средства оценки количества жизнеспособных бактерий H. pylori в посевных материалах, но в этом случае сначала необходимо построить кривую роста. Для этого значения A600 культур H. pylori отслеживаются с течением времени и напрямую коррелируют с числом жизнеспособных бактерий, определенным методом подсчета в планшетах.
заметка: Удобным методом для определения такой кривой роста является культивирование бактерий в жидкой среде (раздел 1.2) с использованием стандартных плоскодонных колб для культуры тканей, помещенных в инкубатор с 10% содержаниемCO2. Количество КОЕ, определенное по аликвотам культур, полученных каждые 4–6 ч в течение 2–3 дней, затем сравнивают с соответствующими значениями A600. Важно отметить, что кривые роста должны быть построены для каждого штамма H. pylori, поскольку они могут расти с разной скоростью, и, кроме того, не все штаммы хорошо растут при 10%CO2.
2. Внутрижелудочный зонд мышей с хеликобактером
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод внутрижелудочного зондирования может быть применен к другим видам бактерий, которые колонизируют кишечник, например, S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Используйте мышей мужского пола или самок в возрасте 6–8 недель, свободных от специфических патогенов (SPF) и Helicobacter. Используйте животных с генетическим фоном C57BL/6 для экспериментов с инфекцией H. pylori или H. felis. В настоящем исследовании мы использовали мышей дикого типа (WT) и генетически модифицированных мышей C57BL/6, у которых отсутствовал ключевой рецептор врожденного иммунитета (называемых нокаутными или KO-животными).
заметка: Мыши с другим генетическим фоном также могут быть использованы для лечения инфекций Helicobacter, однако уровень колонизации и тяжесть заболевания могут зависеть от типа фона хозяина.
- Отсадите бактериальный посевной материал (Шаг 1.5) в одноразовые шприцы объемом 1 мл и замените прилагаемые иглы иглами 23 калибра, к которым прикреплены одноразовые полиэтиленовые катетеры (длина 6–8 см; внутренний диаметр 0,58 мм). Закрепите катетеры на иглах с помощью небольших полосок полиэтиленовой пленки (см. Таблицу материалов). В качестве альтернативы замените узел иглы/катетера с помощью стерильных пластиковых подающих трубок (20 калибр x 38 мм).
- Физически удерживайте мышей крепким хватом за загривок и хвост><.
заметка: Эта процедура может быть выполнена без анестезии, или же с использованием ингаляционного анестетика, такого как метоксифлуран или изофлуран.
- Вставьте катетер в центр открытой челюсти и направьте его в каудальном направлении к пищеводу. Вытяните горловину мыши, чтобы обеспечить легкий доступ к желудку через пищевод (и в сторону от трахеи) до тех пор, пока большая часть или весь катетер не станет видимым и не будет ощущаться сопротивление, соответствующее основанию желудка. Подайте определенную аликвоту, обычно 100 мкл на одну инокуляцию (рис. 1).
заметка: Мышей следует колоть ≥ 105 КОЕ для обеспечения оптимальной колонизации и патологии заболевания.
