Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Посев клеток брюшины в слайдах канала
- После пипетирования суспензии перитонеальных макрофагов мыши вверх и вниз для уменьшения комкообразования пипетируйте 100 мкл суспензии в предварительно заполненный канал (объем, 100 мкл) предметного стекла, покрытого фибронектином (канал объемом 100 мкл имеет размеры (длина х ширина х высота): 50 мм х 5 мм 0,4 мм).
- Предварительно заполните камеру, добавив 1 мл сыворотки RPMI 1640 (Hepes) среды в один из двух резервуаров канального салазки, наклонив салазку, а затем отасунув среду из расположенного ниже по потоку резервуара (рис. 1).
- Удалите нежелательные пузырьки воздуха или длинные полоски воздуха в канале, добавив 1–2 мл среды в один из двух резервуаров, плотно накрыв крышку резервуара, а затем откачав воздух за счет ритмичного давления большим пальцем на крышку и, при необходимости, наклонив предметное стекло. После вытеснения воздуха наклоните заслонку с незакрытым резервуаром (и содержащей среду) вниз, прежде чем снять крышку, чтобы избежать всасывания воздуха обратно в канал.
- Инкубируйте засеянное клетками предметное стекло во влажной камере в течение 2 ч при 37 °C в отсутствие CO2 (CO2 не требуется, так как буферная система HCO3-/CO2 заменена Hepes). Канальные горки можно удобно разместить на стойке, которая вмещает восемь горок. Обычно из одной мыши готовят 6–8 горок, хотя возможно и до 10 и более.
- Снимите штатив и замените среду RPMI 1640 (Hepes) в каждом предметном стекле на среду RPMI 1640, содержащую бикарбонат, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, а также пенициллин/стрептомицин.
- Наклоните заслонку и аспирируйте среду сначала из нижнего резервуара, а затем из верхнего. Затем добавьте 1 мл новой среды в один из резервуаров, наклоните заслонку и отсасывайте среду из нижестоящего резервуара после того, как она протекет по каналу.
- После этого этапа промывки (обмена среды) заполните канал предметного стекла, добавив 1 мл среды в один из резервуаров.
заметка: Этапы промывки с помощью канальных стекол очень просты и эффективны с точки зрения замены раствора и удаления неадгезивных клеток. Обратите внимание, что среда RPMI 1640 (бикарбонатная) обычно предварительно инкубируется с 5%CO2 в течение ночи для обеспечения теплового равновесия и равновесия pH.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2. Проведите эксперименты на следующий день.
2. Выделение эритроцитов человека
- На 2-й день (второй день экспериментов; после ночной инкубации выделенных перитонеальных макрофагов) соберите 1–2 мл периферической венозной крови от здорового донора в гепаринизированную пробирку. Переложите 1 мл в микроцентрифужную пробирку с круглым дном объемом 2,0 мл (полипропилен), центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 18 °C (эмпирическая настройка) и удалите надосадочную жидкость (плазму и охристый слой).
- Осторожно отасуньте 100 мкл осажденных эритроцитов и смешайте этот объем 1:1 с модифицированной средой RPMI 1640 (Hepes) (описанной ниже) в микроцентрифужной пробирке с круглым дном объемом 2,0 мл. Промаркируйте трубку "1:1".
заметка: Среда RPMI 1640 (Hepes), используемая на 2-й день (для анализов) после выделения клеток, содержит, помимо 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки, пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и 1 мМ N-(2-меркаптопропионил)глицин (для снижения фототоксичности). В дальнейшем эта среда именуется «модифицированной» средой RPMI 1640 (Hepes).
- Пипетку 4 мкл разбавленной суспензии эритроцитов в соотношении 1:1 в модифицированную среду RPMI 1640 (Hepes) объемом 2 мл, предварительно отпипетированную в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл (повторите этот шаг, т.е. подготовьте 2 пробирки). Пометьте каждую пробирку "4:2000". Поместите трубки «1:1» и «4:2000» на лед.
3. Мечение плазматической мембраны макрофага
- Извлеките засеянные предметные стекла из инкубатора CO2 и замените среду RPMI 1640 (бикарбонат) в каждом предметном стекле на модифицированную среду RPMI 1640 (Hepes). Затем поместите клетки во влажную камеру при температуре 37 °C при отсутствии CO2,
заметка: После ночной инкубации и промывания большая часть лимфоцитов удаляется из канала. Большинство оставшихся адгезивных клеток являются макрофагами, которые могут быть идентифицированы либо морфологически, либо путем иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против F4/80. Около 95% резидентных перитонеальных макрофагов мышей являются F4/80-положительными.
- Разведите флуоресцентно меченное зеленым цветом антитело против мыши F4/80 (хранящееся при 4 °C) в соотношении 1:40 в модифицированной среде RPMI 1640 (Hepes). Возьмите предметное стекло, наклоните его и пипеткой (капля за каплей) внесите 100 μL смеси антител в отверстие 100-литрового канала предметного стекла (см. Рисунок 1). Аспирационная среда, которая впадает в нижестоящий резервуар. Инкубируйте клетки в течение 20 минут при температуре 37 °C (увлажненная среда, без CO2). В течение инкубационного периода маркируйте эритроциты человека (см. раздел 5).
заметка: Как упоминалось выше, CO2 не требуется, поскольку буферная система HCO3-/CO2 заменена Hepes.
- После 20-минутного времени инкубации (в течение которого эритроциты человека окрашиваются и опознаваются) промойте предметное стекло, добавив 1 мл модифицированной среды RPMI 1640 (Hepes) в один из резервуаров и аспирируя среду после того, как она протекает по каналу, чему способствует наклон предметного стекла. Добавьте 1 мл среды для кратковременного хранения или приступайте к эксперименту (т.е. пипетированию в частицах (опсонизированных эритроцитах) и визуализации фагоцитоза с помощью покадровой конфокальной микроскопии с вращающимся диском).
4. Мечение плазматической мембраны эритроцитов человека
- Мечение эритроцитов человека начинают немедленно после инкубации предметного стекла макрофагов с зелеными флуоресцентно мечеными антителами против F4/80 (после раздела 3.2). После осторожного перемешивания возьмите 400 мкл из одной из пробирок "4:2000" (см. раздел 2.3) и выдавите его в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл (круглое дно). Дайте время суспензии нагреться примерно до 37 °C (см. пункт ниже). Добавьте 0,4 μл оранжевого/красного флуоресцентного красителя для плазматической мембраны (аликвоты хранятся при -20 °C), перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.<бр/>
заметка: Нагреваемый алюминиевый блок, помещенный внутрь ламинарного вытяжного колпака, полезен для минимизации потерь тепла при подготовке слайдов. Трубы могут быть размещены в скважинах нагревательного блока, а в качестве рабочего места может служить отдельная или встроенная алюминиевая пластина с подогревом.
- После 5-минутного периода инкубации приготовьте первый этап промывки, добавив 1600 мкл модифицированной среды RPMI 1640 (Hepes) (для заполнения микроцентрифужной пробирки объемом 2,0 мл).
- Центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 5 минут при 18 °C (эмпирическая настройка). Компактная красная гранула должна быть видна на стене (т.е. смещена от центра) в нижней части пробирки. Поверните трубку так, чтобы таблетка была обращена вверх, и осторожно удалите всю надосадочную жидкость последовательно (в два этапа) с помощью наконечника для пипетки объемом 1–1,5 мл.
- После аспирации надосадочной жидкости добавьте 2 000 мкл модифицированной среды RPMI 1640 (Hepes), перемешайте (для ресуспендирования клеток) и повторите описанные выше этапы центрифугирования и аспирации надосадочной жидкости.
- Ресуспендируйте гранулу (окрашенную плазматической мембраной и 2-кратно промытые эритроциты) 400 мкл модифицированной среды RPMI 1640 (Hepes). Пометьте пробирку PMS (аббревиатура от plasma membrane stain).
заметка: В качестве альтернативы, сукцинимидиловый эфир pH-чувствительного производного родамина, который становится более сильно флуоресцентным при кислом pH, может быть использован для маркировки эритроцитов человека. В этом случае интенсивность флуоресценции дополнительно служит мерой созревания фагосом после того, как частицы были интернализованы.
5. Опсонизация (мечение) эритроцитов человека мышиным иммуноглобулином G (IgG)
- Добавьте 1 мкл мышиного (IgG2b) моноклонального (клон HIR2) антитела к человеческому CD235a (1 мг/мл) (хранящийся при -20 °C) в пробирку, меченную PMS (см. разделы 4.2–4.5), содержащую окрашенные на плазматическую мембрану эритроциты человека, суспензированные в среде объемом 400 мкл. CD235a (также известный как гликофорин А) является эритроидным мембранным сиалогликопротеином, специфичным для линии.
- Инкубировать при 37 °C в течение 8 мин. Обратите внимание, что опсонизация эритроцитов человека IgG вызывает агглютинацию (слипание клеток). Хотя агглютинация может служить визуальным индикатором опсонизации, она нежелательна для визуализации одиночных фагоцитарных эффектов. Чтобы обойти агглютинацию, повторно перемешайте клеточную суспензию (каждые 1 мин), используя, например, дозатор переменного объема 20–200 мкл, установленный на 200 мкл.
- К концу 8-минутного инкубационного периода, при желании, промойте предметное стекло макрофага, инкубированное зеленым флуоресцентно меченным антителом против F4/80, 1 мл модифицированной среды RPMI 1640 (Hepes). Убедитесь, что оба резервуара направляющей системы очищены от среды после этапов промывки.
6. Визуализация фагоцитоза красных кровяных телец человека, окрашенных плазматическими мембранами и покрытых IgG
- После 8-минутной инкубации с антителом к CD235a (раздел 5.2) пипетку 100 мкл суспензии, содержащей окрашенные плазматическими мембранами и опсонизированные эритроциты человека, в канал предметного стекла, содержащего макрофаги, меченные зелеными флуоресцентными антителами против F4/80 (этап 3). Таким образом, к зеленым флуоресцентным фагоцитам (макрофагам) добавляются красные флуоресцентные, IgG-опсонизированные эритроциты человека.
- Как только эритроциты человека будут добавлены, установите предметное стекло на конфокальный микроскоп с вращающимся диском (с температурой инкубатора 37 °C) для визуализации, например, через объектив с масляной иммерсией 60X/1,49. Начните визуализацию как можно скорее, так как частицы начинают оседать в течение 1 мин.<бр/>
заметка: С помощью флуоресцентных шариков диаметром 100 нм мы измерили, анализируя функции разброса точки, разрешения XY x = 0,22 мкм, y = 0,23 мкм (лазер 488 нм) и x = 0,27 мкм, y = 0,27 мкм (лазер 561 нм). Однако, чтобы уменьшить фотообесцвечивание и фототоксичность во время покадровой 3D-визуализации живых клеток, мы идем на компромисс с пространственным разрешением, используя биннинг 2 x 2. Биннинг повышает чувствительность (улучшает соотношение сигнал/шум) и допустимую частоту кадров, но за счет пространственного разрешения.
- Используйте идеальную систему фокусировки (или аналогичную), чтобы предотвратить смещение фокуса во время записи. После активации идеальной системы фокусировки используйте регулятор смещения для фокусировки на пластинчатых выступах макрофагов непосредственно над покровным стеклом (см. примечание ниже) предметного стекла канала. Этот уровень фокусировки соответствует Z = 0 мкм. Получаем Z-стеки от -1 мкм до +16 мкм с шагом 0,8 мкм, что составляет 22 Z-среза. Z-стеки можно, например, получить со скоростью 1 стек (для каждого канала) каждые 15 с, что в сумме составляет 16 мин.<бр/>
заметка: Более длительные периоды записи приводят к потере качества изображения, в основном из-за фотообесцвечивания. Z-стеки собираются для каждого из двух каналов: макрофаги визуализируются с помощью лазера с длиной волны 488 нм (зеленый канал), а эритроциты человека визуализируются с помощью лазера с длиной волны 561 нм (красный канал). Используя этот подход, можно получить различные представления о том, как макрофаги поглощают IgG-опсонизированные эритроциты человека в разные моменты времени (например, см. рисунок 2).
заметка: Типичные настройки системы (с биннингом 2 x 2): зеленый канал (мощность лазера 20,5% (50 мВт; 488 нм), чувствительность 101 (диапазон, 0–255) и время экспозиции 200 мс); мощность красного канала (10,5% лазера (50 мВт; 561 нм), чувствительность 101 (дальность, 0-255) и время экспозиции 98 мс).
заметка: Нижняя часть предметного стекла канала изготовлена из полимера той же толщины, что и стеклопакет #1.5, и обладает теми же оптическими свойствами, что и стекло, но, что примечательно, материал имеет преимущество газопроницаемости.
