Кальцеиновое ацетоксиметиловое окрашивание для оценки цитотоксичности, опосредованной естественными клетками-киллерами по отношению к раковым клеткам

Аннотация

Источник: Chava, S. et al., Измерение цитотоксичности и миграции, опосредованной естественными киллерами, в контексте опухолевых клеток печени. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует анализ для измерения цитотоксичности естественных клеток-киллеров против раковых клеток с использованием красителя Calcein AM. Снижение количества флуоресцентных раковых клеток после кокультивирования с естественными киллерами указывает на цитотоксичность, опосредованную естественными киллерами, по отношению к раковым клеткам.

Протокол

1. Микроскопический метод окрашивания Calcein AM для измерения цитотоксичности, опосредованной NK-клетками

1. Культивирование клеток SK-HEP-1 до 70−80% конфлюенции. Получить суспензию для одиночных клеток путем промывания клеток 5 мл 1x PBS с последующей инкубацией с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА.
2. Центрифугируйте клетки SK-HEP-1 в стерильной центрифужной пробирке объемом 1 мл при давлении 160 х г в течение 3 мин. Ресуспендируйте гранулу в 3 мл бессывороточного DMEM.
3. Добавьте 1,5 мкл раствора кальцеина AM (10 мМ) в клетки SK-HEP-1 и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Центрифуга кальцеином меченых АМ клеток SK-HEP-1 при концентрации 160 x g в течение 3 мин в стерильной центрифужной пробирке объемом 15 мл.
4. Дважды промойте ячейки 5 мл 1x PBS, чтобы удалить избыток кальцеина AM-красителя.
5. Параллельно центрифугируйте клетки NK92MI при давлении 160 x g в течение 3 мин в стерильной центрифужной пробирке объемом 15 мл. Промойте клеточную гранулу один раз 5 мл 1x PBS и повторно суспендируйте в 5 мл клеточной среды NK92MI.
6. Подсчитайте клетки SK-HEP-1, меченные кальцеином AM, и клетки NK92MI с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
7. Ресуспендируйте клетки SK-HEP-1 в культуральной среде со скоростью 1 x 10⁵ клеток/мл и NK92MI со скоростью 1 x 10⁶ клеток/мл в среде NK-клеток.
8. Пластинчатый кальцеин, меченные AM клетками SK-HEP-1 (целевые клетки) (1 x 10⁴/100 мкл/лунка) с клетками NK92MI (эффекторные клетки) (1 x 10⁵/100 мкл/лунка) (соотношение мишени: эффектор 1:10) на лунку в тройных лунках в 96-луночном планшете.
9. Инкубируйте 96-луночные планшеты при 37 °C в атмосфере 95% воздуха и 5%_CO2 в течение 4 часов. После инкубации сделайте флуоресцентные изображения клеток, меченных кальцеином AM, с помощью флуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением. Захватите не менее 10 различных полей каждой репликации для каждого условия лечения.
10. Случайным образом выберите 10 изображений для каждой репликации и подсчитайте кальцеин-положительные меченые клетки-мишени, инкубированные с клетками NK92MI или без них. Рассчитайте % цитотоксичности по приведенной ниже формуле.
    
    заметка: В качестве контроля используйте клетки-мишени без клеток NK92MI и полностью лизированные клетки-мишени в качестве полного контроля лизиса. Для полного лизиса клетки инкубируют в 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч (20 мкл 5% Triton X-100 в 200 мкл питательных сред).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кальцеин AM краситель	Сигма-Олдрич	17783
DMEM	Gibco	11965-092 Номер 11965-092
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	26140079
Сыворотка для лошадей	Gibco	16050114
Элементы NK92MI	АТКС	КРЛ-2408
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Сигма-Олдрич	П4417
Ячейки СХЭП-1	АТКС	ХТБ-52
Раствор трипсина ЭДТА	Gibco	25200056

г.