Измерение миграции естественных клеток-киллеров в ответ на хемотаксические стимулы

Аннотация

Источник: Chava, S., et al. Измерение цитотоксичности и миграции, опосредованной естественными киллерами, в контексте опухолевых клеток печени. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует метод изучения миграции естественных киллеров (NK) клеток через систему вставок пористой мембраны в ответ на хемоаттрактанты. Этот метод позволяет проводить количественный анализ миграции NK-клеток с помощью проточной цитометрии.

Протокол

1. Анализ миграции NK-клеток

1. Выращивайте клетки NK92MI и центрифужные клетки при 160 x g в течение 3 минут в стерильной центрифужной пробирке объемом 15 мл.
2. Дважды промойте клеточную гранулу 5 мл 1x PBS и повторно суспендируйте клетки в 3 мл клеточной среды NK92MI, не содержащей сыворотки. Подсчитайте клетки NK92MI с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
3. Пластинчатые ячейки NK92MI (2,5 x 10⁵ ячеек/100 мкл/лунка) в верхнем отсеке трансвелловой проницаемой камеры (вставка диаметром 6,5 мм и размер пор 5 мкм).
4. В нижнюю камеру добавьте 0,6 мл бессывороточной среды, содержащей материал, который необходимо проверить на свойства хемоаттрактанта NK-клеток (например, кондиционированная среда, хемокины, цитокины).
   заметка: При приготовлении кондиционированной среды используйте среду с восстановленной сывороткой без добавления сыворотки, чтобы исключить интерференцию сывороточных белков в анализе миграции.
5. Инкубируйте 24 хорошо проницаемые камеры при температуре 37°C в течение 4 часов. Через 4 ч соберите неадгезивные и мигрировавшие клетки NK92MI из нижней камеры и перенесите их в пробирки для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) для дальнейшего анализа.
   заметка: Время культивирования может варьироваться в зависимости от типа клеток-мишеней, а также количества и кинетики хемокинов, продуцируемых клетками-мишенями. Поэтому это время должно быть определено эмпирически для каждого типа клеток, хемокина и эксперимента.
6. Добавьте заданное количество счетных шариков для проточной цитометрии в объеме 50 мкл в каждую пробирку, содержащую мигрировавшие NK-клетки. Оцените объем суспензии клеток в концентрации 300 μл/лунку с помощью любого проточного цитометра, способного автоматизировать подсчет клеток на основе FACS.
   заметка: Тщательно перемешивайте или перемешивайте вихревые шарики для проточной цитометрии каждый раз перед использованием, чтобы обеспечить постоянное количество шариков для минимизации экспериментальной изменчивости. Для поддержания точности рекомендуется проводить обратное пипетирование с помощью счетных шариков. Используйте только NK-клетки и счетные шарики для проточной цитометрии в качестве контрольных элементов анализа FACS. Авторы рекомендуют прочитать не менее 10 000 шариков + NK-клеток вместе взятых, и это количество хорошо сработало. Однако это число может варьироваться в зависимости от условий эксперимента. Поэтому суммарное количество шариков + NK-клеток должно быть определено опытным путем для каждого типа эксперимента. Кроме того, важно проводить эксперименты с использованием биологических трипликатов для достижения статистически значимых результатов и учета вариабельности между различными количествами клеток.
7. Вычислите абсолютное количество перенесенных ячеек NK92MI по следующей формуле:
   
   где A = количество клеток, B = количество бусин, C = назначенное количество бусин партии (количество подсчитывающих бусин для проточной цитометрии/50 μL; в данном примере 49 500), а D = объем образца (μL).
   заметка: Если для анализа FACS использовать 300 мкл объема образца (мигрировавшие клетки) и 50 мкл счетных гранул для проточной цитометрии, то абсолютное число мигрировавших клеток = 1 700 клеток / 3 300 событий гранул x 49 500 гранул / 300 мкл = 84,975 клеток/мкл. Расчет должен быть скорректирован, если образец разбавлен или если используется другой объем счетных бусин FACS.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Абсолютный подсчет бусин	Thermo Fisher Scientific	С36950
Элементы NK92MI	АТКС	КРЛ-2408
Ячейки СХЭП-1	АТКС	ХТБ-52
Проницаемые камеры Transwell	Костар	No 3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Сигма-Олдрич	П4417
Альфа-MEM	Сигма-Олдрич	М4256