1. Готовьте комплемент и целевые бактерии
- Подготовьте крольчатина комплемента (BRC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные критерии выбора дополнительного лота можно найти здесь: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Получить замерзший BRC и разморозить проточной холодной водой. Физически перемешивайте BRC каждые ~10-20 минут до полного оттаивания. Не подвергайте BRC повторным циклам замораживания-оттаивания.
- Во время размораживания BRC наклейте этикетку на центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, 5 мл или 15 мл. Поместите пробирки с маркировкой на лед для предварительного охлаждения. Внесите нужный объем BRC в предварительно охлажденные центрифужные пробирки (после заполнения немедленно верните каждую пробирку в лед). Хранить аликвоты при температуре ≤ -70 °C в морозильной камере.<бр/>
заметка: Примерно 1 мл комплемента необходим для каждой пластины для анализа. Дополнительные аликвоты предназначены для одноразового использования и должны быть аликвотированы в объемах, соответствующих схемам анализа.
- Для приготовления инактивированного при нагревании BRC разморозьте одну аликвоту активного BRC. Приготовьте водяную баню при температуре 56 °C. После того как BRC полностью разморозится, перенесите его на водяную баню и выдержите в течение 30 минут.
- После инкубации удалите инактивированный теплом BRC с водяной бани и дайте ему остыть при комнатной температуре (RT) в течение 10-15 мин. Энергично перемешайте и добавьте от ~150 μл до 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Хранить аликвоты при температуре ≤ -10 °C.
- Подготовьте целевой бактериальный бульон
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенная ниже методика используется для получения 48 аликвот целевого бактериального запаса; Если требуется больше аликвот, протокол можно масштабировать.
- Извлеките из морозильной камеры основной флакон с бактериями и соскребите замороженную бактериальную поверхность, чтобы удалить небольшое количество льда из флакона на тарелку с кровяным агаром. Сразу же верните основной бульон бульона в морозильную камеру.
- Нанесите эту небольшую аликвоту бактериального запаса на пластину с кровяным агаром и накройте ее крышкой для тарелки. Инкубируйте планшет вверх дном в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2.
- Перенесите ~10 изолированных гладких колоний в пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл бульона LB. Выдерживать в течение 3-5 ч при 37 °C с легким встряхиванием, пока культуральный бульон не достигнет наружного диаметра600 ~0,6-0,7.
- Соберите верхние 12,5 мл культуры и переложите в свежую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте культуру при давлении 15 000 x g в течение 2 минут с помощью настольной микроцентрифуги. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл 15% стерильного глицерина-LB.
- Хорошо перемешайте и распределите по 0,5 мл аликвот в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (~48 пробирок). Хранить аликвоты при температуре ≤ -70 °C в морозильной камере.
- Перед использованием подтвердите бактериальную идентичность с помощью теста на агглютинацию.
- Определение оптимального коэффициента разбавления целевого бактериального запаса
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая партия целевых бактерий должна быть титрованная в условиях анализа для определения разведения, необходимого для получения ~120 КОЕ/пятно на планшетах LB.
- Возьмите планшет для микротитрования (Dilution Plate) и добавьте 135 μL Assay Buffer в лунку 1A. Добавьте 120 μL Assay Butter в лунки 1B-1H.
- Достаньте флакон с замороженными целевыми бактериями из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре. Добавьте 15 мкл размороженного бактериального запаса в лунку 1А, чтобы получить 10-кратное разведение бактериального запаса.
- Перенесите 30 мкл бактериального раствора из лунки 1А в лунку 1В для выполнения 5-кратного серийного разведения. Продолжайте 5-кратное серийное разведение до лунки 1H, всего 8 разведений (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
- Возьмите еще одну микротитровую пластину (Assay Plate) и добавьте 20 μL Assay Buffer во все лунки в столбцах 1 и 2 в Assay Plate.
- 10 мкл разбавленных бактерий переносят из каждой лунки в столбце 1 пробирной пластины в соответствующие лунки в колонках 1 и 2 пробирной пластины. 10 мкл бактерий переносят из лунки 1А разбавляющей пластины в лунки 1А и 2А в пробирной пластине и т.д.
- Продолжайте анализ, как описано в Бактерицидном анализе сыворотки крови (SBA) ниже для контроля А и контроля В, шаги 3.6-3.12.
- После того как планшеты были инкубированы на льду, используйте многоканальную пипетку с 8 наконечниками для пипетки, чтобы обнаружить 10 мкл из лунок в столбце 1 на планшете LBA. Кроме того, определите лунки из столбца 2 на пластине LBA.
- Продолжайте анализ, как описано ниже, в шагах 3.14-4.6.
- Определите разведение бактерий, которое дает ~120 КОЕ/пятно в контроле В, это разведение будет использоваться в анализе.
2. Бактерицидный анализ сыворотки крови (SBA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная ниже процедура предназначена для одной пробирной пластины, но количество пробирных пластин может быть увеличено.
- Нагревание тестовых образцов путем инкубации образцов в водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин.<бр/>
заметка: Перед испытанием испытуемые образцы должны быть инактивированы при нагревании, чтобы отменить любую эндогенную активность комплемента. Это можно сделать до начала анализа, а инактивированные образцы можно повторно заморозить или хранить при температуре 4 °C до проведения испытаний.
- Возьмите пробирную пластину и добавьте 20 мкл пробирного буфера в столбцы с 1 по 12 строк от A до G. Добавьте 20 мкл пробирного буфера в столбцы 1 и 2 строки H, см. таблицу 1.
- Загрузите по 30 мкл каждого испытуемого образца в двух экземплярах в ряд H пробирной пластины. Например, 30 мкл образца 1 следует распределить в лунки 3Н и 4Н, а 30 мкл образца 2 – в лунки 5Н и 6Н и т.д.
- Выполняйте 3-кратное последовательное разведение исследуемых образцов с помощью многоканальной пипетки.
- Извлеките 10 μ пробы из лунок 3H-12H и перенесите ее в соответствующие лунки в ряду G и хорошо перемешайте пробу пипетированием вверх и вниз 8-10 раз.
- Затем снимите 10 μ из лунок 3G-12G и переложите в соответствующие лунки в ряд F и хорошо перемешайте.
- Продолжайте эти последовательные разведения в строке А. После смешивания лунок в ряду А удалите и отбракуйте 10 мкл из лунок 3А-12А так, чтобы все лунки содержали 20 мкл<бр/>
заметка: Поскольку в общем объеме анализа 80 мкл используется 20 мкл сыворотки, в анализе происходит 4-кратное дополнительное разведение. Это разведение необходимо учитывать при расчете титра SBA путем умножения разведения сыворотки на 4. Например, если используется начальное разведение 1:2, то фактическое тестируемое разведение составляет 1:8.
- Извлеките один флакон замороженного бульона Target Bacteria Stock и разморозьте при комнатной температуре. Разведите бактерии в 20 мл буфера для анализа в соответствии с заранее определенным оптимальным коэффициентом разведения (этот коэффициент разведения был определен в разделе 1.3). Добавьте по 10 мкл разведенных бактерий в каждую лунку пробирного планшета с помощью многоканальной пипетки.
- Извлеките один флакон замороженного BRC и один флакон замороженного BRC, инактивированного при нагревании, разморозьте при комнатной температуре в проточной холодной воде или поместите на решетку шкафа биологической безопасности с продувкой воздуха для быстрого оттаивания.
- Приготовьте 20% раствор термоинактивированного BRC. Смешайте 100 мкл инактивированного при нагревании BRC с 400 мкл буфера для анализа. Добавьте 50 мкл этого 20% инактивированного теплом раствора BRC во все лунки в столбце 1 (контрольные лунки А).
заметка: Инактивированный при нагревании BRC используется в качестве контроля для мониторинга неспецифического убийства (NSK) в анализе.
- Приготовьте 20% раствор нативного BRC. Смешайте 1 мл нативного BRC с 4 мл буфера для анализа. Добавьте по 50 мкл этой смеси во все лунки в столбцах со 2 по 12 (контрольные В и тестовые пробные лунки).<бр/>
заметка: Конечная концентрация BRC в реакционной смеси составляет 12,5%.
- Кратковременно перемешайте пробирную пластину, осторожно встряхивая в течение 10-15 секунд на шейкере, или перемешайте, пипетируя вверх и вниз 8 раз с помощью многоканальной пипетки.
- Поместите пробирную пластину в микробиологический инкубатор при температуре 37 °C на 2 ч (не встряхивая).
- Высушите 2 пластины LBA, сняв крышки и поместив пластины лицевой стороной вверх в шкаф биологической безопасности на 40-60 минут.
- Когда 2-часовая инкубация будет завершена, переместите пробирную пластину во влажный лед и инкубируйте в течение 10-20 минут, чтобы остановить реакцию.
- С помощью 12-канальной пипетки перемешайте лунки в ряду H и нанесите 10 мкл реакционной смеси на дно планшета LBA. Сразу же наклоните пластину и дайте пятнам пробежать ~1,5-2 см. Повторите эту процедуру для рядов G, F и E, расположив их над предыдущим рядом на пластине LBA. Ряд E, F, G и H отмечены на одной пластине LBA, а ряды A, B, C и D — на второй пластине LBA таким же образом, см. Рисунок 1.
- Инкубируйте планшеты LBA при комнатной температуре, пока раствор не адсорбируется в планшетах LBA (10-15 минут). Закройте пластины LBA крышками и поместите их в микробиологический инкубатор вверх дном для инкубации в течение ночи (~16-18 часов). Инкубировать Shigella flexneri 2a и 3a при 29 °C и S. sonnei при 26 °C.
заметка: При таких температурах образуются более мелкие «микроколонии» с размерами, подходящими для точного подсчета с помощью счетчика колоний9.
- После ночной инкубации добавьте 25 мл агара Overlay (при температуре ~55 °C), содержащего 100 мкг/мл TTC и 0,1% NaN3, в каждую пластину LBA.
- Инкубируйте планшеты LBA при температуре 37 °C в течение 2 часов, чтобы выжившие бактерии приобрели красный цвет, см. рисунок 1 ниже.
- Фотопластинки с помощью цифровой камеры и передача изображений на компьютер, на котором установлено программное обеспечение NIST Integrated Colony Enumerating Software (NICE), см. рисунок 2.
заметка: Программное обеспечение для подсчета колоний NICE доступно бесплатно. Подробные сведения и инструкции по установке см. в разделе «Список материалов».
Таблица 1: Схема пробирного планшета. В столбцах 1 и 2 расположены контрольные лунки комплемента. Элемент управления А расположен в столбце 1 и представляет собой инактивированный при нагревании контроль комплемента, содержащий буфер SBA, бактерии и инактивированный при нагревании комплемент. Контроль B расположен в столбце 2 и представляет собой активный контроль комплемента, содержащий буфер SBA, бактерии и комплемент. Столбцы 3-12 содержат образцы сыворотки. Каждый образец прогоняют в двух экземплярах и последовательно разбавляют в 3 раза от ряда Н до ряда А
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| a | Управление А | Управление В | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 | Разведение 8 |
| В | Управление А | Управление В | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 | Разведение 7 |
| С | Управление А | Управление В | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 | Разведение 6 |
| Г | Управление А | Управление В | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 | Разведение 5 |
| Е | Управление А | Управление В | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 | Разведение 4 |
| Ф | Управление А | Управление В | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 | Разведение 3 |
| Г | Управление А | Управление В | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 | Развод 2 |
| Ч | Управление А | Управление В | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 | Разведение 1 |
| | | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | Образец 4 | Пример 5 |
