$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение меченых CFSE апоптотических тимоцитов
- Усыпить двух наивных мышей C57/B6 с помощью ингаляции CO2 в течение 10 мин и вскрыть грудную полость, удалить (вытащить) тимус с помощью изогнутых щипцов с тонким концом в тканевой культуре чашки Петри, содержащей 10 мл RPMI1640 среды.
- Получить одноклеточную суспензию можно путем измельчения всего тимуса на двух матовых концах предметного стекла микроскопа, а затем отфильтровать суспензию через клеточный фильтр толщиной 100 мкм.
- Соберите суспензию тимуса объемом 10 мл в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте в 40 мл 1x PBS и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать в 20 мл 1x PBS в пробирке объемом 50 мл в виде суспензии для одного клетки с количеством до 2 x 108 клеток (если более 2 x 108 клеток, ресуспендировать остальные клетки в других 20 мл 1 x PBS в другой пробирке объемом 50 мл).
- Внесите 5 мкМ CFSE в равном объеме (20 мл) 1x PBS в отдельную пробирку объемом 50 мл, пипетируя 40 мкл стокового раствора CFSE (2,5 мМ) в 20 мл 1x PBS, и хорошо перемешайте, перевернув пробирку 2-3 раза.
- Добавьте 20 мл CFSE из стадии 1.7 в 20 мл клеточной суспензии из стадии 1.6 (конечная концентрация CFSE теперь составляет 2,5 мкМ).
заметка: На каждые 20 мл клеточной суспензии требуется 20 мл пробирки CFSE.
- Переверните ячейку и пробирку смеси CFSE 2 - 3 раза и выдержите смесь в темноте при комнатной температуре не более 2 минут, затем остановите реакцию, добавив 10 мл инактивированной теплом лошадиной сыворотки.
- Центрифугируйте смесь пробирок объемом 50 мл при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
заметка: Если маркировка CFSE прошла успешно, клеточная гранула станет светло-желтой.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 40 мл 1x PBS и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Еще раз промойте гранулу ячейки 40 мл RPMI1640 среды.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки RPMI1640 питательной средой для тканевых культур (RPMI1640, 20 мМ HEPES, 10% FBS (инактивированный при нагревании), 20 мМ глутамина и 1x Pen/Strep) в концентрации 7 x 106 клеток/мл в 100 мм чашке для культуры тканей><.
заметка: Если клеток будет получено больше, потребуется отдельная 100-миллиметровая чашка для культуры тканей.
- Добавляйте ставроспорин в культуру клеточной суспензии в конечной концентрации 1 мкМ и культивируйте в течение 4 ч при 37 °С в инкубаторе для тканевых культур, снабженном 5%СО2.
2. Получение перитонеальных макрофагов
- Введите двум мышам C57B6 (или любым генетически манипулированным мышам в лаборатории) внутрибрюшинно 1 мл 3% состаренного тиогликоллата в 0-й день.
- Усыпьте мышей на 5-й день, как описано в шаге 1.1, разрежьте и очистите кожу брюшной полости, но оставьте брюшину нетронутой. Промойте брюшную полость, быстро протолкнув 10 мл промывочного буфера (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% ЭДТА) в брюшную полость с помощью шприца объемом 10 мл, прикрепленного к игле 18 G.
- Медленно извлеките промывочный буфер с помощью той же иглы/шприца и соберите промывочный буфер в промывочный пробирку объемом 50 мл.
- Дважды промыть брюшную полость 1x PBS, ресуспендировать перитонеальные макрофаги в RPMI1640 среде для культуры тканей с плотностью 2 x 106 клеток/мл и аликвотой 500 мкл в каждую лунку 24-луночного планшета. Оставьте планшет в инкубаторе для тканевых культур на 2 ч.
- Удалите плавающие клетки, аспирировав и заменив их 500 μл свежей питательной среды дважды.
- По желанию добавляют ингибитор тирозина рецептора TAM, RXDX-106, в концентрациях, указанных в подписях к рисунку, в каждую лунку культуры макрофагов и инкубируют еще 2 ч.
3. Совместное культивирование перитонеальных макрофагов с апоптотическими тимоцитами
- Соберите апоптотические тимоциты с шага 1 и трижды промойте RPMI1640 средой. На этом этапе эффективность апоптотической индукции можно измерить с помощью комплекта Annexin V/7-AAD.
- Распределите 0 - 12 x 106 клеток (в среде объемом 500 мкл) в каждую лунку культур макрофагов из протокола #2, в соответствии с экспериментальной схемой (например, см. рис. 1). Это делает весь объем культуры 1 мл в каждой лунке 24-луночного планшета. Добавляйте блокирующее антитело в культуру непосредственно перед добавлением апоптотических тимоцитов.
- Культивировать клеточную смесь при 37 °С в течение 4 ч в инкубаторе для культуры тканей, снабженном 5%СО2.
- Промойте каждую лунку культуры 1x PBS (содержащим 500 мкМ ЭДТА) дважды, чтобы удалить свободно плавающие апоптотические клетки.
- На этой стадии окрашивайте макрофаги, связанные с пластинами, CD11b-PE.
- Промойте макрофаги, связанные с планшетами, с помощью окрашивающего буфера (1x PBS, 1% BSA) один раз.
- Добавьте в каждую лунку 200 мкл окрашивающего буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE.
- Инкубируйте пластину при температуре 4 °C в течение 20 минут.
- Промойте каждую лунку тарелки три раза с помощью буфера для окрашивания.
- Добавьте 200 мкл буфера для окрашивания и приступайте к анализу изображения под флуоресцентным микроскопом.
