$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Поляризация HMDM
- В стерильных условиях готовят М1-прайминг среды путем добавления интерферона γ (IFNγ; 20 нг/мл) и липополисахарида (ЛПС; 1 мкг/мл) в полную питательную среду RPMI-1640. Подготовительную среду М2 приготовить, добавив интерлейкин 4 (IL-4; 20 нг/мл) в полную питательную среду RPMI-1640.
- В стерильных условиях аспирировать среду из лунок тканевых культуральных планшетов, содержащих макрофаги, полученные из моноцитов человека, HMDM, которые были засеяны и культивированы, как описано в разделе 1.
- Тщательно промойте лунки, содержащие клетки, 3 раза стерильным PBS (предварительно подогретым до 37 °C), используя 1 мл аликвоты PBS.
- Добавьте 1 мл грунтовочной среды M1 или M2 в каждую лунку, содержащую HMDM (в зависимости от того, что подходит для эксперимента).
- Инкубировать клетки в течение 48 ч при 37 °C в присутствии 5%CO2 в клеточном инкубаторе.
2. Стимуляция HMDM для индуцирования высвобождения MET
- В стерильных условиях готовят питательные среды, содержащие различные стимуляторы внеклеточных ловушек макрофагов с выпуском MET (в зависимости от того, что подходит для эксперимента) в полные среды RPMI-1640: PMA (25 нМ), человеческий рекомбинантный TNFα (25 нг/мл) или человеческий рекомбинантный IL-8 (50 нг/мл).
- Для экспериментов с хлорноватистой кислотой, стимуляции HOCl, готовят HOCl (200 мкМ) в HBSS (предварительно подогрев до 37 °С), непосредственно перед добавлением в клетки. Убедитесь, что HOCl не готовится в полноклеточных средах.
заметка: Концентрацию исходного раствора HOCl количественно определяют путем измерения поглощения УФ-излучения раствора при длине волны 292 нм и pH = 116 и с использованием коэффициента экстинкции 350 М-1 см-1.
- После поляризационной обработки, описанной в разделе 2, отсадите клеточную среду из каждой лунки и тщательно промойте клетки 3 раза 1 мл аликвот: стерильного PBS (для PMA, TNFα и IL-8) или HBSS (для HOCl), которые были предварительно нагреты до 37 °C.
- Для экспериментов с PMA, TNFα или IL-8: добавьте 1 мл готовой среды, содержащей PMA, TNFα или IL-8, после удаления PBS на заключительном этапе промывки.
- Для экспериментов с TNFα клетки инкубируют в течение 6 ч при 37 °C в присутствии 5% CO2 в клеточном инкубаторе. Для экспериментов с PMA и IL-8 клетки инкубируют в течение 24 ч при 37 °C в присутствии 5%CO2 в клеточном инкубаторе.
- Для экспериментов с HOCl добавьте 1 мл HOCl в HBSS после удаления HBSS на заключительном этапе промывки. Затем инкубируйте клетки в течение 15 мин при 37 °C в присутствии 5%CO2 в клеточном инкубаторе.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость клеток и промойте клетки 3 раза 1 мл аликвот HBSS, как описано в шаге 2.3.
- После удаления HBSS с последней стадии промывки добавьте 1 мл полной питательной среды RPMI-1640. Затем инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C в присутствии 5%CO2 в клеточном инкубаторе.
3. Визуализация MET в культуре живых клеток
- Приготовьте зеленый краситель SYTOX в HBSS в концентрации 40 мкМ.
- В конце обработок, описанных в разделе 2, для индуцирования высвобождения MET необходимо непосредственно добавить 25 мкл 40 мкМ красителя в каждую лунку, содержащую HMDM.
- Инкубируйте клетки при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут в темноте.
- Поместите HMDM в лунки для культуры тканей на предметном столике инвертированного флуоресцентного микроскопа для визуализации.
- Процедуры микроскопа
- Включите источник флуоресцентного света широкого спектра, светлопольный источник света и инвертированный микроскоп с цветной цифровой камерой высокого разрешения (см. Таблицу материалов).
- Поверните колесо фильтра в положение «номер 2» для зеленой флуоресценции (возбуждение = 504 нм, излучение = 523 нм) для визуализации окрашенных в зеленый цвет образцов, содержащихся в лунках для культуры тканей.
- Используя объектив 5x, сфокусируйте изображение с помощью грубой фокусировки, затем с помощью ручек точной фокусировки на микроскопе, пока изображение не станет четким, четким и сфокусированным при просмотре через окуляр микроскопа.
- Переключите микроскоп в режим камеры.
- Запустите соответствующее программное обеспечение.
- Выберите вкладку «Захват» в программном обеспечении.
- Нажмите кнопку «Воспроизвести» для предварительного просмотра изображения и отрегулируйте ручку точной фокусировки на микроскопе до тех пор, пока изображение не станет четким, четким и сфокусированным в окне предварительного просмотра программного обеспечения.
- Нажмите кнопку Захват.
заметка: Полученное изображение будет автоматически отображено в прилагаемом программном обеспечении.
- В программном обеспечении нажмите Файл | Сохраните как требуемый тип файла изображения.
- На микроскопе поверните колесо фильтров в положение «номер 5» для получения светлопольной визуализации и повторите шаги 3.5.2–3.5.9 для получения соответствующего светлопольного изображения.
- Повторите шаги 3.5.2–3.5.10 по мере необходимости для последующего получения изображения.