Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Очистка полиморфноядерных лейкоцитов человека и выделение сыворотки крови человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны регулярно проверяться на наличие эндотоксина с использованием коммерчески доступного набора для обнаружения эндотоксинов и должны содержать эндотоксин <25,0 пг/мл для предотвращения нежелательного прайминга PMN.
- Доведите до 50 мл 3% декстрана-0,9% NaCl (по массе), 35 мл 0,9% NaCl (по массе), 20 мл 1,8% NaCl (по массе), 12 мл градиента плотности 1,077 г/мл и 20 мл инъекционной или ирригационной воды до комнатной температуры.
- Чтобы выделить человеческую сыворотку, инкубируйте 4 мл свежей человеческой крови без антикоагулянта при температуре 37 °C в стеклянной пробирке объемом 15 мл в течение 30 минут. После инкубации образец центрифугируют при концентрации 2000–3000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Переложите верхний слой сыворотки в свежую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и положите ее на лед.
- Смешайте 25 мл свежеполученной гепаринизированной (1000 ЕД/мл) цельной человеческой крови с 25 мл 3% декстрана-0,9% NaCl комнатной температуры (соотношение 1:1) в двух повторяющихся конических центрифужных пробирках объемом 50 мл (общий объем 50 мл на пробирку). Перемешайте, осторожно покачивая каждую коническую пробирку объемом 50 мл, а затем дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут.
- После инкубации при комнатной температуре появятся два отдельных слоя. Переложите верхний слой каждой смеси декстрана и крови в новые конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 450 x g в течение 10 минут при комнатной температуре с низким тормозом или без него.
- Осторожно аспирируйте обе надосадочные жидкости и выбросьте их, не нарушая клеточные гранулы. Осторожно ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 2 мл 0,9% NaCl комнатной температуры, соедините ресуспендированные гранулы в одной конической пробирке объемом 50 мл, затем добавьте оставшиеся 0,9% NaCl (окончательный объем 35 мл).
- Осторожно подложите 10 мл раствора градиента плотности 1,077 г/мл комнатной температуры под клеточную суспензию с помощью ручной пипетки. Вращайтесь со скоростью 450 x g в течение 30 минут при комнатной температуре с низкими тормозами или без них. Аккуратно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Надосадочная жидкость будет содержать мононуклеарные клетки периферической крови, которые могут быть собраны так, как описано ранее.
- Лизируйте эритроциты, суспендируя клеточную гранулу в 20 мл воды комнатной температуры. Аккуратно перемешайте, покачивая трубку в течение 30 секунд. Лизис эритроцитов будет сопровождаться выраженным снижением помутнения.
- Немедленно добавьте 20 мл 1,8% NaCl (при комнатной температуре [RT]) и центрифугируйте образец при 450 × г в течение 10 минут при комнатной температуре><.
заметка: Важно свести к минимуму время, в течение которого PMN остаются в воде после лизиса эритроцитов, чтобы максимизировать выход PMN и предотвратить лизис и/или активацию PMN.
- Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл среды RT RPMI 1640 и положите ее на лед.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендируйте очищенные PMN в концентрации 1 x 107 клеток/мл с помощью ледяного RPMI и держите их на льду.
- Смешайте 100 мкл очищенных PMN (1 x 106 клеток) с 300 мкл ледяного фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS), содержащего 1 мкл красителя йодида пропидия, в двух пробирках проточной цитометрии. Для положительного контроля повреждения плазматической мембраны добавьте 40 μл 0,5% раствора Triton X-100 в одну из пробирок проточной цитометрии и тщательно перемешайте.
- С помощью проточной цитометрии измеряют прямое рассеяние, боковое рассеяние и окрашивание йодидом пропидия (максимумы возбуждения/эмиссии при 535/617 нм) очищенных клеток (рис. 1).
заметка: Анализ прямого и бокового рассеяния позволит выявить нежелательные популяции лимфоцитов и моноцитов. Йодид пропидиума окрашивает только клетки с нарушенной плазматической мембраной, и не следует использовать очищенные ПМН, которые имеют выраженные популяции йодид-положительных клеток пропидиума. Для этих исследований очищенные ПМН использовались только в том случае, если они составляли >98% очищенных клеток и <5% окрашены положительно на йодид пропидия.
- Подготовьте 96-луночный планшет для анализа цитотоксичности PMN, покрыв отдельные лунки, которые будут использоваться в этом анализе, 100 мкл 20% изолированной сыворотки человека, разбавленной DPBS.
заметка: Нанесение PMN непосредственно на пластик или стекло вызовет активацию клеток. Обязательно включите по крайней мере одну отрицательную контрольную лунку, которая будет получать только среду, и по крайней мере одну положительную контрольную лунку, которая будет получать 0,05% Triton X-100.
- Выдержать тарелку при температуре 37 °C в течение 30 минут. После инкубации дважды промойте лунки с покрытием ледяным DPBS, чтобы удалить излишки сыворотки. Осторожно постучите по пластине вверх дном, чтобы удалить остатки DPBS, и положите ее на лед.
- Осторожно добавьте 100 мкл очищенных человеческих PMN в концентрации 1 x 107 клеток/мл в каждую лунку с покрытием (1 x 106 PMNs/лунка). Дайте PMN осесть в лунках, инкубируя пластину на льду в течение не менее 5 минут. Держите планшет ровно, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек в каждой лунке, и оставьте его на льду, чтобы избежать нежелательной активации PMN.
2. Анализ цитотоксичности внеклеточных белков S. aureus против полиморфноядерных лейкоцитов человека
- Культивировать S. aureus в течение ночи в триптическом соевом бульоне (БТС) с помощью встряхивающего инкубатора, установленного при температуре 37 °С. Для этих исследований 20 мл TSB в отдельных колбах Эрленмейера объемом 150 мл инокулировали замороженными культурами штаммов S. aureus USA300 или USA300ΔsaeR/S и выращивали в течение примерно 14 ч с встряхиванием при 250 об/мин.
- Субкультура S. aureus путем разведения бактериальной культуры в соотношении 1:100 в течение ночи свежей средой. Инкубировать при температуре 37 °C с встряхиванием до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней неподвижной фазы роста.
заметка: Для этих экспериментов 20 мл триптического соевого бульона в 150 мл колб Эрленмейера инокулировали 200 мкл культивируемого на ночь USA300 или USA300ΔsaeR/S и инкубировали при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин в течение 5 ч.
- Когда бактерии достигнут ранней неподвижной фазы роста, перенесите 1 мл субкультивированного S. aureus в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при температуре 5000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
- После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в шприц объемом 3 мл. Пропустите надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм и поместите ее в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на льду.
- Проводят серийные разведения надосадочной жидкости ледяными средами, используемыми для культивирования S. aureus.
заметка: Для показанных экспериментов надосадочная жидкость из USA300 и USA300ΔsaeR/S подвергалась четырем последовательным 1/2 логарифмическим разведениям ледяным TSB.
- Осторожно добавляйте образцы надосадочной жидкости или только среды (для отрицательного и положительного контроля) в отдельные лунки 96-луночных планшетов, содержащих PMN на льду, начиная с шага 1.15. Для этих экспериментов в каждую лунку добавляли по 10 мкл образцов надосадочной жидкости USA300 или USA300ΔsaeR/S. Аккуратно раскалывать плиту для распределения надосадочной жидкости в лунках и инкубировать при 37 °C.
- В нужное время вынимайте тарелку из инкубатора и ставьте ее на лед. Добавьте 40 мкл 0,5% Triton X-100 в положительную контрольную лунку.
- Аккуратно пипетируйте образцы вверх и вниз в каждой лунке, чтобы полностью удалить все PMN, прилипшие к планшету, затем перенесите образцы в проточные цитометрические пробирки на льду, которые содержат 300 μL ледяного DPBS с 1 μL йодида пропидия.
- Измерьте долю йодид-положительных PMN пропидия с помощью проточной цитометрии (рис. 2A). При связывании с ДНК йодид пропидида имеет возбуждение/излучение на длине волны 535/617 нм.
