Анализ цитотоксичности штаммов Staphylococcus aureus на нейтрофилы после фагоцитоза

Аннотация

Источник: Dankoff, J. G. et al., Количественная оценка цитотоксичности золотистого стафилококка против полиморфноядерных лейкоцитов человека. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем анализ для определения цитотоксичности вирулентных и менее вирулентных штаммов S.taphylococcus aureus против нейтрофилов человека после фагоцитоза с помощью проточной цитометрии.

Протокол

1. Анализ цитотоксичности S. aureus против полиморфноядерных лейкоцитов человека после фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Кривые роста, определяемые оптической плотностью на длине волны 600 нм (OD600) и концентрацией бактерий, должны быть определены эмпирически для штаммов S. aureus, подлежащих тестированию, прежде чем начать этот анализ. Успех этих экспериментов требует последовательного сбора равных концентраций каждого штамма S. aureus, испытанного в среднеэкспоненциальной фазе роста с использованием OD600 субкультурных бактерий.

1. Начните культивирование штаммов S. aureus и субкультуральных бактерий в течение ночи, как описано ниже.
   1. Культивировать S. aureus в течение ночи в триптическом соевом бульоне (БТС) с помощью встряхивающего инкубатора, установленного при температуре 37 °С. Для этих исследований 20 мл TSB в отдельных колбах Эрленмейера объемом 150 мл инокулировали замороженными культурами штаммов S. aureus USA300 или USA300ΔsaeR/S и выращивали в течение примерно 14 ч с встряхиванием при 250 об/мин.
   2. Субкультура S. aureus путем разведения бактериальной культуры в соотношении 1:100 в течение ночи свежей средой. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием.
2. Соберите субкультивируемый S. aureus, когда он достигнет среднеэкспоненциального роста><, перенеся 1 мл культивируемых бактерий в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируя при 5 000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. заметка: В наших условиях роста USA300 и USA300ΔsaeR/S достигли среднеэкспоненциальной фазы роста примерно через 135 минут инкубации.
3. После центрифугирования промойте S. aureus путем аспирации надосадочной жидкости, суспендирования гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, вортексирования образца в течение 30 с и центрифугирования при 5000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Опсонизируйте S. aureus путем ресуспендирования бактериальной гранулы в 1 мл 20% сыворотки крови человека, разведенной с помощью DPBS, и инкубации при 37 °С с перемешиванием в течение 15 мин.
5. Центрифугируйте опсонизированные бактерии при давлении 5000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Промойте S. aureus после центрифугирования путем аспирации надосадочной жидкости, суспендирования гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, а затем вортексирования образца до полного разрушения бактериальной гранулы плюс дополнительные 30 секунд. Центрифугируйте бактерии при 5 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
6. Ресуспендируйте опсонизированные штаммы S. aureus в 1 мл RPMI, переведите образец в вихрь до полного разрушения бактериальной гранулы, а затем еще на 30 с. Поместите бактерии на лед.
7. Разбавляют опсонизированные штаммы S. aureus до нужной концентрации с помощью ледяного RPMI. Вихрь на 30 с и поместите на лед.
8. Подтвердите концентрацию опсонизированного S. aureus путем нанесения 1:10 серийных разведений бактерий на триптический соевый агар.
   заметка: Поскольку различия в концентрации бактерий, используемых в этом анализе, могут оказать существенное влияние на последующую проницаемость плазматической мембраны PMN (рис. 1A), важно, чтобы концентрация каждого тестируемого штамма определялась для каждого эксперимента и была эквивалентной между штаммами.
9. Осторожно добавьте 100 мкл/лунку каждого штамма S. aureus или RPMI (для положительного и отрицательного контроля) к PMN в 96-луночном планшете на льду. Аккуратно покатать плиту для распределения S. aureus по лункам.
10. Синхронизируйте фагоцитоз путем центрифугирования планшета при 500 × г в течение 8 мин при 4 °C. Инкубируйте планшет при 37 °C сразу после центрифугирования (T = 0).
11. В нужное время вынимайте тарелку из инкубатора и ставьте ее на лед. Добавьте 40 мкл 0,5% Triton X-100 в положительную контрольную лунку.
12. Осторожно пипетируйте образцы вверх и вниз в каждой лунке, чтобы полностью удалить все PMN, прилипшие к планшету, затем перенесите образцы в проточные цитометрические пробирки на льду, содержащие 200 μL ледяного DPBS с 1 μL йодида пропидия.
13. Анализ образцов на окрашивание йодидом пропидида с помощью проточной цитометрии.
14. Измерьте долю йодид-положительных PMN пропидия с помощью проточной цитометрии. При связывании с ДНК йодид пропидида имеет возбуждение/излучение на длине волны 535/617 нм.

Результаты

Рисунок 1: Анализ проточной цитометрии PMN после фагоцитоза S. aureus. (A) Доля положительных PMN пропидида йодида через 90 мин после фагоцитоза различных концентраций USA300 или USA300∆saeR/S. (B) Концентрация опсонизированных штаммов S. aureus, использованных для экспериментов, показана на панели А. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM 4 отде...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с защелкивающимися крышками	ВВР	89000-044	Используется в моечных камерах
12x75 мм Пробирки для культивирования	ВВР	60818-430	Используются в качестве пробирок для проточной цитометрии
Конические центрифужные пробирки объемом 50 мл	ВВР	89039-656	Для диспенсационных сред
Bacto Tryptic Соевый бульон, соевая и казеиновая среда для переваривания	FischerScientific	211823	Для выращивания клеточных культур
Гемоцитометр Bright-Line	Сигма-Олдрич	Z359629	Аппарат для подсчета клеток
DPBS, 1x (фосфатный буферный раствор Дульбекко) с кальцием и магнием	Корнинг	21-030-CV	Используется в моечных камерах
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	Очистка ПМН
Стерильные полистирольные одноразовые серологические пипетки Fisherbrand	FischerScientific	13-678-11Э	Для аспирации жидкости
Пластины Greiner CELLSTAR на 96 лунок	Миллипора Сигма	М0687	Плита для удержания экспериментальных образцов
Шприцевые фильтры OMICRON	Омикрон Сайентифик	SFPV13R	Для фильтрации надосадочной жидкости
Йодид пропидия	ThermoFisher Scientific	П3566	Непроницаемое для мембраны окрашивание ДНК
PYREX Марка 4980 Колбы Эрленмейера	Коул-Пармер	EW-34503-24	Для выращивания клеточных культур
RPMI 1640, 1X без L-глютамина, фенол красный	Корнинг	17-105-ЛВ	Используется в ресупензионных элементах
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Х100	Положительный контроль целостности мембраны