Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Штаммы и условия культивирования
Примечание: В этом исследовании используется штамм M. tuberculosis CDC1551, но любой штамм M. tuberculosis может быть использован таким же образом.
- Выращивайте бактерии в среде M-OADC-TW (бульон 7H9 с добавлением 0,5% глицерина, 10% комплекса декстрозы олеиновой кислоты без каталазы и 0,05% Tween-80) при температуре 37 °C до наружного диаметра600 0,5 (~ 0,2 x 107 колониеобразующая единица или КОЕ).
- Разведите культуру в M-OADC-TW (серия разведений бактерий в соотношении 1:10). Нанесите разведения бактерий (10,5, 10,6, 10, 7, 10,8) в трех экземплярах на селективные планшеты 7H11, чтобы можно было определить КОЕ.
- Инкубируйте планшеты в течение четырех недель при температуре 37 °C или до тех пор, пока не будут точно подсчитаны колонии.
- Центрифугируйте бактериальный инокулянт при 8,534 х г в течение 5 мин для получения гранулы. Промойте гранулу один раз 10 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и повторно суспендируйте гранулу в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl).
2. Аэрозольная инфекция мышей с использованием камеры Мэдисона
- Дайте мышам акклиматизироваться к новой обстановке в течение недели.
- Взвесьте мышей перед тем, как загрузить их в камеру.
- Подключите к удлинителю три шнура: основную камеру, вакуумный насос и воздушный компрессор в указанном порядке.
- Аккуратно открутите стеклянную банку. Принесите стеклянную банку в шкаф биобезопасности и добавьте провокационный инокулят, взвешенный в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) для достижения ~ 104 - 106 КОЕ бактерий в легких.
- Закройте крышку стеклянной банки в шкафу биобезопасности. Прикрепите банку к небулайзеру и отрегулируйте вертикальную трубку из нержавеющей стали так, чтобы нижний (впускной) конец находился примерно на четверть дюйма ниже уровня жидкости в банке.
- Загрузите в камеру всех необходимых для эксперимента животных (камера может вместить до 90 мышей) и закройте все защелки на дверце.
- Проверьте основной (комнатный) расходомер воздуха. Убедитесь, что центр поплавка (шара) движется со скоростью около 50 л/мин, как указано на шкале слева.
- Нажмите кнопку «Пуск» на панели управления камерой. Установите расход воздуха через расходомер компрессора (меньший измеритель слева) как 4 л/мин на шкале. Проверьте визуально, чтобы убедиться, что провокационный инокулюм распыляется.
- Через 15 минут, когда на передней панели панели управления загорится красный индикатор и раздастся звуковой сигнал, указывающий на окончание пробега, нажмите кнопку «Сброс» в правом нижнем углу панели управления, чтобы сбросить таймеры.
- Удерживайте маленькую красную кнопку на дверце камеры, чтобы выпустить вакуум.
- Откройте дверцу камеры и уберите животных. Поместите мышей обратно в клетки.
- Снимите стеклянную банку с небулайзером и поместите ее в герметичный транспортировочный контейнер. Поместите контейнер внутрь шкафа биобезопасности и выбросьте суспензию в специальный контейнер для отходов.
- Поместите использованную банку из-под небулайзера в пакет с биологически опасными свойствами и закройте пакет для транспортировки в автоклав.
- В конце процедуры заражения опрыскайте внутреннюю часть камеры буферным фенолом и 70% этанолом и оставьте камеру на 10 минут.
- Затем очень тщательно протрите все доступные внутренние поверхности. Утилизируйте все загрязненные бумажные полотенца и т.д. в мусорном ведре биологической опасности. Автоклав мусора, контейнеров для отходов, а также использованных банок из-под небулайзера.
- Поместите животных обратно в камеру содержания до момента получения изображения.
- В день визуализации перенесите животных во вторичном контейнере в комнату визуализации.
3. Анестезия животных
- Обезболивайте мышей изофлураном с помощью специальной системы газовой анестезии.
- Взвесьте каждую из двух канистр с угольным фильтром, расположенных в верхней части анестезиологического блока.
- Замените канистру на новую, если вес на 50 г превышает первоначальный вес.
- Проверьте блок испарителя, чтобы убедиться в достаточном количестве изофлурана для процедуры.
- Поместите держатель носового конуса внутрь камеры визуализации. Установите необходимое для процедуры количество конусов носа и закройте оставшиеся отверстия блокираторами конуса носа.
- Включите подачу кислорода из баллона высокого давления и установите его на 55 фунтов на квадратный дюйм.
- Включите вакуумный насос, расположенный перед наркозным аппаратом, и установите его на 8 л/мин.
- Включите кислородный тумблер, расположенный перед наркозным аппаратом.
- Включите поток газа в индукционную камеру для анестезии, чтобы установить расход газа на уровне 1,5 л/мин. Выключите поток газа.
- Включите подачу газа в камеру визуализации, чтобы установить расход газа на уровне 0,25 л/мин. Выключите подачу газа.
- Включите вапорайзер изофлурана и установите его на 2 - 2,5%. Отрегулируйте уровень изофлурана в зависимости от количества и веса животных, используемых для эксперимента, вращая диск на испарителе изофлурана (2 - 2,5% для мыши массой ~20 г; 4% для морской свинки массой 300 г).
- Поместите мышей в анестезиологическую камеру и закройте крышку. Включите подачу газа в индукционную камеру для анестезии.
- Оставьте мышей в анестезиологической индукционной камере на 5 - 10 минут до полного обезболивания.
- После того, как мыши будут обезболены, нанесите на глаза оптическую мазь, чтобы защитить их во время визуализации.
- Поместите мышей в вентральное или грудное лежачее положение так, чтобы их носы были помещены в носовой конус, чтобы облегчить анестезию мышей во время процедуры визуализации.
4. Визуализация флуоресценции репортерного фермента (REF)
- Введите субстрат (20 мкМ, 2,5 мкл/г веса) путем внутрибрюшинной инъекции инфицированным, а также контрольным мышам. Мыши находятся под анестезией в камере визуализации менее 1 минуты.
- Запустите систему визуализации.
- Инициализируйте систему, нажав на кнопку «Инициализировать». Подождите, пока температурная шкала загорится зеленым.
заметка: Камера визуализации состоит из подогреваемой платформы для поддержания температуры тела животного во время визуализации.
- Для настройки получения изображений выберите Флуоресцентный | Транс-иллюминация для всего животного или эпи-подсветка для легочных тканей, структура и наложение на панель управления захватом.
- Установите поле зрения на B для одной мыши, а уровень индикатора — на высокий.
- Установите время экспозиции на авто, среднее объединение, 2–3 для f/ступени, а также фильтр возбуждения на 745 нм и фильтры излучения от 780 нм до 840 нм.
- Для настройки последовательности нажмите на кнопку Sequence Setup (Настройка последовательности) и выберите 9–12 точек транс-подсветки в области легких.
- Нажмите «Получить» для получения изображения.
- Поместите мышь обратно в клетку после визуализации.
- Наблюдайте за мышами до полного выздоровления или пожертвуйте ими для количественного определения КОЕ при визуализации в определенный момент эксперимента. Выполните модифицированную шкалу Карновски для мониторинга самочувствия мышей после визуализации.
