Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение и дифференцировка макрофагов, полученных из костного мозга (BMM)
- День 0: Принесите в жертву 4 - 6-недельную самку мыши C57BL/6 или BALB/c в камере CO2 и подтвердите смерть от вывиха шейки матки. Обеспечьте стерилизацию ножниц и щипцов, пропитав их 70% этанолом. Распыляйте перчатки с 70% этанолом, чтобы обеспечить стерильное обращение на протяжении всего процесса выделения клеток костного мозга.
- Прикрепите принесенную в жертву мышь к доске для вскрытия, приколов ее передние конечности и продезинфицировав обильно распылив 70% этанол.
- Сделайте небольшой надрез (около 1 см) ножницами возле тазобедренного сустава. Осторожно вставьте ножницы под кожу, чтобы отделить подлежащую мышцу, и разрежьте кожу вокруг тазобедренного сустава.
заметка: Доска для вскрытия может быть повернута, чтобы обеспечить улучшенный доступ к тазобедренному суставу.
- Аккуратно снимите кожу с ноги, потянув в сторону лодыжки и сняв ее. Отрежьте ступню по щиколотке, очень осторожно разрезая голеностопный сустав или ниже, чтобы оставить большеберцовую кость полностью неповрежденной.
заметка: Малоберцовая кость на этом этапе прикреплена слабо и может быть легко отделена с помощью щипцов.
- Вручную определите местоположение тазобедренного сустава, манипулируя бедренной костью, чтобы определить точку вращения. Осторожно с помощью ножниц разрежьте ногу выше тазобедренного сустава, чтобы оставить проксимальную головку бедренной кости нетронутой.
- Удалите с ноги как можно больше мышц и соединительной ткани с помощью ножниц. Удалите остатки кожи с голеностопного сустава и излишки костного материала над тазобедренным суставом.
- Поместите очищенные кости ног в стерильную Мемориальный институт Розуэлл Парк RPMI с добавлением пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация 1%) в чашке Петри на льду.
- Повторите шаги с 1.4 по 1.6, чтобы отделить большеберцовую и бедренную кости от другой задней ноги.
- Удалите остатки мышц и соединительной ткани из костей, замоченных в RPMI, с помощью стерилизованных щипцов и стерильного лезвия #10.
- Выложите косточки на крышку чашки Петри. Осторожно разрежьте большеберцовую кость лезвием непосредственно над голеностопным суставом, чтобы получить доступ к костному мозгу. Удалите большеберцовую кость от остальной части ноги, разрезав сразу ниже коленного сустава.
- Наберите 10 мл стерильного RPMI с добавлением пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация 1%) в шприц объемом 10 мл и прикрепите иглу 25G.
- Крепко удерживайте большеберцовую кость щипцами вертикально над конической трубкой объемом 50 мл на льду. С помощью шприца осторожно введите примерно 5 мл RPMI в конец кости, чтобы вымыть костный мозг с другого конца в коническую трубку. Промойте костный мозг в общей сложности 10 мл RPMI до тех пор, пока кость не станет белой.
заметка: После тщательного промывания косточка должна побелеть. Если нет, продолжайте промывку, чтобы удалить костный мозг. Дистальный конец большеберцовой кости может потребоваться обрезать лезвием, если он слишком узкий для введения иглы.
- Разрежьте бедренную кость непосредственно над коленным суставом и сразу ниже тазобедренного сустава, чтобы обнажить оба конца кости для доступа к костному мозгу. Промыть костный мозг из бедренной кости общим объемом 10 мл RPMI таким же образом, как и большеберцовую кость.
- Повторите шаги очистки и промывки с 1.6 по 1.13 с оставшимися костями и соберите промытые клетки костного мозга в одну коническую пробирку объемом 50 мл
заметка: Если кость сломалась в любой момент во время вскрытия до промывания кости, не используйте костный мозг из этой кости.
- Центрифугируйте коническую трубку, используемую для сбора костного мозга, промытого из всех четырех костей, в течение 10 мин при 4 °С при 300 х г.
- Поместите 60 мл стерильной среды BMM (RPMI с конечной концентрацией 20% фетальной бычьей сыворотки, FBS, 1% пенициллин/стрептомицин, 1,2 мМ Na-пирувата, 25 мкг/мл человеческого макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в колбу для клеточной культуры размером 175см2 с фильтрующей крышкой.
- Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования и повторно суспендируйте клеточную гранулу путем осторожного пипетирования вверх и вниз с использованием 5 мл среды BMM из колбы.
- Перенесите клеточную суспензию в культуральную колбу и дважды промойте коническую трубку средой BMM из культуральной колбы, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток. Убедитесь, что клеточная суспензия тщательно перемешана в среду, и распределите 30 мл из первой колбы для клеточных культур размером 175 см2 во вторую колбу для клеточных культур размером 175 см2 со фильтрующей крышкой.
- Инкубируйте обе колбы, содержащие по 30 мл клеточной суспензии каждая, в течение ночи при 37 °C, 5% углекислого газа (CO2), чтобы обеспечить отделение любых загрязняющих фибробластов, резидентных макрофагов и других адгезивных клеток.
- ДЕНЬ 1: Перенесите надосадочную жидкость, содержащую недифференцированные клетки костного мозга, из колб в чашки Петри из полистирола размером 100 мм x 15 мм в концентрации примерно 10 мл/чашку и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2.Выбросьте колбы.
- ДЕНЬ 3 или 4: Добавьте еще 5 мл среды BMM (предварительно подогретой до 37 °C) в каждую чашку Петри и продолжайте инкубацию при 37 °C, 5%CO2.
2. Покрытие BMM на покровных стеклах для инфекции (ДЕНЬ 7 или 8)
- Подготовьте 6-луночные планшеты для культивирования тканей, поместив четыре (4) стерильных стеклянных покровных стекла толщиной 12 мм (автоклавированных и хранящихся в закрытом стеклянном контейнере) на дно каждой пустой лунки.
заметка: Подберите каждый стерильный покровный колпак толщиной 12 мм с помощью аспирационного наконечника, установленного на вакуумной линии. Поместите покровные стекла в лунки без перекрытия, освободив их в нужном положении, зажав трубку, чтобы прервать вакуум.
- Аспиратную среду (и любые неадгезивные клетки) из чашек Петри покрыть адгезивными макрофагами, полученными из костного мозга, и аккуратно промыть адгезивные клетки 2 раза стерильным фосфатным буферным физиологическим раствором Дульбекко без хлорида кальция и магния (PBS -/-), предварительно подогретым до 37 °C.
- Добавьте по каплям 5 мл стерильной 1x PBS -/- с конечной концентрацией 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в каждую чашку Петри и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C для отделения адгезивных BMM. Проверьте отделение клеток с помощью микроскопа.
- Соберите все отделенные клетки, взвешенные в 1x PBS -/- с добавлением 1 мМ ЭДТА в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте каждую посуду 2 раза 5 мл PBS -/- и добавьте в бассейн с клеточной суспензией.
заметка: Клеточную суспензию можно разбавлять дополнительным PBS -/- для защиты макрофагов от токсичности ЭДТА в процессе сбора.
- Центрифугировать при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Отбросить надосадочную жидкость и ресуспендировать макрофаги в среде 5 - 10 мл BMM с помощью пипетирования. Поместите ресуспендированные клетки на лед, чтобы предотвратить прикрепление к трубкам и слипание.
- Подсчет жизнеспособных клеток с помощью исключения трипанового синего в гемоцитометре.
заметка: Для подсчета BMM-клеток, ресуспендированных в среде с концентрацией 5 мл, смесь разбавления из суспензии клеток 25 мкл в PBS 445 мкл -/- и 30 мкл 0,4% раствора трипанового синего обычно позволяет легко количественно определить с помощью гемоцитометра (с учетом 20-кратного коэффициента разбавления для окончательного расчета). Учитывайте только те клетки, которые не были окрашены трипановым синим (жизнеспособные клетки). Объем клеточной суспензии может быть изменен, если эта смесь слишком концентрирована или разбавлена. В целом, выход BMM на один препарат колеблется от 2 x 107 до 5 x 107 клеток от одной мыши.
- Приготовьте клеточную суспензию в среде BMM с желаемой концентрацией покрытия (5 x 105/мл) и диспергируйте суспензию на 6 луночных планшетах в среде по 2 мл на лунку таким образом, чтобы каждая лунка получила 1 x 106 макрофагов.
заметка: Это критически важный шаг, который гарантирует, что каждая скважина получит достаточное количество макрофагов для равномерного покрытия покровных покрытий. Убедитесь, что покровные стекла в скважинах не перекрываются и не плавают в среде. Если это так, аккуратно отрегулируйте с помощью стерильного наконечника для дозатора.
- Инкубировать в течение ночи при 37 °C, 5%CO2.
3. Очищение от инфекционных форм Leishmania amazonensis
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте Leishmania к инфекциям - очистите метациклические промастиготы от стационарных культур промастиготы или дифференцируйте промастиготы в культуре в форму амастигота, используя стандартный протокол аксенической дифференцировки L. amazonensis.
- Очистка метациклических промастигот Leishmania с использованием градиентных сред плотности (Материалы)
- Приготовьте 40% исходный раствор градиентной среды в стерильной воде, не содержащей эндотоксинов.
- Раствор градиента плотности развести в 10 раз в среде М199 (без сыворотки) до получения 10% концентрации в среде М199.
- Фильтруйте все растворы через фильтр 0,22 мкм.
заметка: Стоковые растворы можно хранить при температуре 4 оС в темноте не дольше 1 месяца.
- Добавьте 2 мл раствора градиентной среды 40% плотности на дно конической центрифужной пробирки объемом 15 мл.
Аккуратно нанесите - слой 2 мл раствора градиента плотности 10% в M199 поверх слоя фильтрующего материала с градиентом плотности 40%, используя пипетку Пастера, чтобы избежать смешивания между двумя слоями.
- Соберите 1 x 109 паразитов из стационарной фазовой культуры центрифугированием при 1900 x g в течение 10 минут.
- Ресуспендируйте клетки в модифицированной эфирной среде Dulbecco (DMEM) объемом 6 мл.
- Нанесите слой 2 мл клеточной суспензии непосредственно поверх слоя среды с градиентом плотности 10%, осторожно, используя пипетку Пастера, чтобы избежать смешивания между слоями.
- Центрифугируйте градиент в течение 10 мин при 1 300 x g при комнатной температуре.
заметка: Из-за различий в физических свойствах между видами Leishmania условия центрифугирования для каждого из них, возможно, придется немного скорректировать, чтобы обеспечить максимальный выход.
- Соберите паразитов (обогащенных метациклической промастиготной формой) из полосы, образованной на верхней границе среды с градиентом плотности 10% (граница раздела между слоями среды с градиентом плотности 0% и 10%).
- Разбавьте паразитов одним объемом DMEM и соберите центрифугированием (1900 x g в течение 10 мин при комнатной температуре).
- Ресуспендируйте в среде 500 мкл DMEM и подсчитайте в гемоцитометре для количественной оценки выхода.
- Генерация амастигоот L. amazonensis в условиях аксенического культивирования (низкий pH / повышенная температура)
- Смешайте 5 мл логарифмической культуры промастиготы (pH 7,4 при 26 °C) с равным объемом среды amastigote (pH 4,5) с помощью2 колб по 25 см (всего 10 мл среды) и инкубируйте при 26 °C в течение ночи.
- Сдвиньте колбу с 26 °C на 32 °C.
- Через 3 или 4 дня расщепите культуру в соотношении 1:5 в среде амастигота при температуре 32 °C.
- Проверьте паразитов в течение следующих 3 - 4 дней (максимум 7 дней), чтобы убедиться, что они готовы к использованию при инфекциях.
заметка: Здоровые аксенические амастиготы должны иметь овальную форму, без видимых жгутиков. Частично дифференцированные амастиготы имеют крупную овальную форму с короткими жгутиками. На культуре не должно быть много куртин – большое количество куртинок является признаком нерастущих, погибающих паразитов. Культуру амастигота можно разделить в соотношении 1:5 и поддерживать не более 3 недель.
4. Заражение L. amazonensis
- Разбавляют суспензии паразитов в соответствии с желаемой кратностью инфекции (MOI) (обычно 3-5 метациклических промастигот на макрофаг [MOI 1:3 или 1:5] и 1 амастигот на макрофаг [MOI 1:1]). Добавить Leishmania in PBS -/- в объеме 50 - 100 мкл в каждую лунку, уже содержащую 2 мл среды.
- Инкубировать ВММ в течение 1 ч с амастиготами и 3 ч с метациклическими промастиготами при 34 °C для инфекции.
заметка: Оптимальная температура заражения может варьироваться в зависимости от вида.
- После инкубации тщательно смойте свободных паразитов в каждой лунке 3 раза 2 мл PBS -/- предварительно подогретых до 37 °C.
заметка: Аккуратно распыляйте PBS, чтобы покровные стекла не плавали друг над другом. Аккуратно взболтайте пластину, а затем отасуньте жидкость. Используйте отдельный аспирационный наконечник при использовании нескольких штаммов паразитов, чтобы избежать перекрестного заражения.
- Зафиксируйте пробы через 1 ч или 3 ч, инкубируя каждую лунку с 1,5 - 2 мл 2% PFA в PBS -/- в течение 10 мин. Промойте 3 раза PBS -/-. Не отсасывайте последнюю стирку и охлаждайте пластины, содержащие покровные стекла, в PBS до окрашивания.
- Добавьте по 2 мл свежей среды BMM в каждую лунку на планшетах для дальнейших временных точек и инкубируйте при 34 °C.
- Зафиксируйте оставшиеся временные точки по желанию, как описано в шаге 4.3, и охладите пластины до окрашивания.
5. 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) Окрашивание и монтаж покровного стекла
- Отсадите PBS из лунок, содержащих покровные стекла, и добавьте 1,5 мл PBS -/- с 0,1% неионогенного моющего средства. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем 3 раза промыть 2 мл PBS -/-.
- Добавьте 1 мл PBS -/- с 2 мкг/мл DAPI (разведенный из 5 мг/мл стокового раствора в воде) в лунки, содержащие покровные стекла, и инкубируйте еще 1 ч при комнатной температуре.
заметка: Время инкубации с DAPI имеет решающее значение для правильной визуализации внутриклеточных паразитов Leishmania. Ядра макрофагов окрашиваются быстро, что обусловлено их большим размером и содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), но окрашивание ядер внутриклеточных паразитов происходит медленнее. Таким образом, увеличение времени инкубации сверх того, что требуется для визуализации ядер BMM, необходимо для того, чтобы DAPI мог проникать через плазматическую мембрану паразита и ядерную мембрану паразита. При правильном окрашивании DAPI в дополнение к ядерной ДНК также может быть визуализирована ДНК митохондриальных кинетопластов вблизи жгутикового кармана паразита.
- Промойте каждую лунку, содержащую покровные стекла, 3 раза 2 мл PBS -/- и затем поднимите и переверните покровные стекла с помощью щипцов, чтобы положить камеру стороной вниз, и закрепите на стеклянных предметных стеклах микроскопа с помощью имеющегося в продаже реагента для монтажа, препятствующего выцветанию.
заметка: Покровные стекла чрезвычайно хрупкие и требуют осторожного обращения. Избегайте давления на них, особенно на боковую стенку колодцев при подъеме. Добавление нескольких капель PBS -/- снижает поверхностное натяжение между покровным стеклом и колодцем и облегчает процесс подъема. Игла тонкого калибра может быть использована для извлечения покровных стекол со дна скважины. После установки покровного стекла на ползунок осторожно надавите щипцами, чтобы вытолкнуть пузырьки воздуха из монтажного материала. Если покровное стекло сломано или могло перевернуться в процессе подъема, не устанавливайте его обратно; Просто используйте запасной четвертый покровный лист.
- Охладите предметные стекла до количественного определения.
6. Количественная оценка инфекции
- Исследуйте окрашенные DAPI стекла под флуоресцентным микроскопом, фокусируясь на макрофагах с помощью объектива 100X с иммерсионным маслом (возбуждение при 358 нм; оптимальное излучение при 461 нм).
Убедитесь, что в центре внимания находится слой макрофагов между предметным стеклом и покровным стеклом.
- Количественно определите количество макрофагов (больших ядер, окрашенных DAPI) и количество более мелких ядер амастиготов, сгруппированных вокруг каждого ядра макрофага (см. рисунок 1A, DAPI) для каждого поля зрения, используя ручной счетчик.
заметка: Ядра амастиготы могут быть видны не все в одной плоскости фокуса из-за их небольшого размера. Подсчитайте те, которые видны при фокусировке на ядрах макрофагов, а затем используйте тонкую фокусировку для проверки ядер паразитов в плоскостях выше и ниже ядер макрофагов.
- Перейдите в другое поле зрения, чтобы повторить количественную оценку. Используйте отдельный ключ счетчика для отслеживания количества подсчитанных полей. Перемещайтесь по полям видимости параллельными рядами на каждом покровном листе, чтобы предотвратить наложение подсчета.
- Количественное определение не менее 200 макрофагов на одну защитную ленту. Количественно оценивайте каждую временную точку инфекции в трех экземплярах (3 покровных листа). Засчитывайте четвертый покров, если один из предыдущих не подходит для подсчета из-за перекрытия покровного стекла, плохого крепления, разбития стекла и т.д.
заметка: Если 200 макрофагов не могут быть сосчитаны ни на одном покровном листе, посчитайте запасной четвертый.
- Рассчитайте коэффициенты инфицирования в виде амастигот/макрофагов или амастигот/100 макрофагов и определите процент инфицированных макрофагов на основе исходных количественных данных.
