1. Прохождение органоидных культур
- Добавьте 1 мл холодной базальной среды в матрицу основания в лунку. С помощью микропипетки объемом 1 мл энергично пипетируйте вверх и вниз до тех пор, пока матрица основания не будет разрушена. Переложите в тубу объемом 15 мл. Выложите на лед.
- Возьмите органоиды в пипетке и энергично пипетируйте 10 раз вверх и вниз. Разрушение органоидов можно наблюдать на глаз.
2. Микроинъекция культуры органоидов.
Примечание: Этот протокол может быть использован для микроинъекции бактерий в органоиды. Может быть полезно начать инъекцию с органоидов, которые более восприимчивы к микроинъекциям. Например, органоиды желудка мыши могут вырасти в очень большие кистозные органоиды, на которые легко нацелиться.
- Подготовка материала
- Втяните стеклянный капилляр в две инъекционные иглы с помощью съемника микропипетки, в соответствии с рекомендациями производителей. Съемник микропипетки нагревает стеклянный капилляр в середине и растягивает капилляр на две части, тем самым образуя две стеклянные иглы. Практично вытащить несколько игл и хранить их в чистой чашке Петри.
- Чтобы предотвратить бактериальную инфекцию, удалите антибиотики из всех сред не менее чем на 3 смены среды (= одна неделя). Это позволит развести антибиотики из базальной матрицы. Если вы используете штамм бактерий, устойчивый к определенному антибиотику, добавьте этот конкретный антибиотик, чтобы свести к минимуму вероятность заражения.
- Подготовьте верстак для микроинъекций. Для работы на разных уровнях биобезопасности может потребоваться размещение стереомикроскопа внутри стерильного стола. В соответствии с этим протоколом H. pylori вводят в условиях уровня биобезопасности 2 под стереомикроскопом внутри стерильного стола.
- Культивируйте бактерии в соответствии со стандартными протоколами.
- Чтобы оценить множественность инфекций (MOI), оцените два параметра: количество бактерий и количество клеток на органоид, как описано ниже. MOI может коррелировать с результатами, например, с экспрессией мРНК IL-8 хозяина.
- Чтобы рассчитать бактериальную плотность в растворе инфекции, сначала установите стандартную кривую оптической плотности и колониеобразующих единиц (КОЕ) в соответствии со стандартными протоколами. Оптическая плотность 0,1 на длине волны 550 нм должна дать примерно10-7 КОЕ/мл.
- Чтобы оценить количество клеток на органоид, посчитайте количество органоидов в 1 лунке. Разрушайте органоиды, как описано в шагах 1.1-1.4. После центрифугирования в течение 5 мин при 200 x g и 4 °C добавьте 1 мл раствора ферментативной диссоциации и повторите.
- Инкубировать при 37 °C с повторным встряхиванием в течение 5-10 мин. Определить, диссоциировались ли клетки на отдельные клетки под микроскопом (инвертированный микроскоп типа Leica DMIL при 10-кратном увеличении). При необходимости продлите инкубацию.
- Подсчитайте количество клеток на органоид с помощью гемоцитометра и рассчитайте количество клеток на органоиде. Человеческие желудочные органоиды диаметром около 200 мкм имеют примерно 4000 клеток. Введение 0,2 мкл бактериального раствора с концентрацией 1 x 109 бактерий на мл приводит к приблизительному MOI 50.
- Инъекции органоидов.
Примечание: При микроинъекции стеклянная игла стабилизируется в держателе, которым можно маневрировать в 3 измерениях с помощью микроманипулятора. Органоиды остаются в матрице фундамента внутри скважины. Из-за размера и расположения в скважине не все органоиды одинаково поддаются закачке. Как правило, 30 самых крупных органоидов в одной скважине могут быть нацелены на 5 минут.
- Соберите бактерии и промойте их в прикорневой среде согласно стандартным протоколам.
- Рассчитайте количество бактерий на мл в соответствии с оптической плотностью (см. шаг 2.1.5.1). Развести бактерии до 1 х10 9 бактерий на мл в базальной среде.
- Возьмите стеклянную иглу. С помощью щипцов разломайте кончик так, чтобы отверстие было примерно 10 мкм в ширину.
- Вставьте иглу в инъекционный держатель и зафиксируйте его на микроманипуляторе.
- Наберите в иглу примерно 10 мкл бактериального раствора.
- Поместите под стереомикроскоп 4-луночный планшет с низкими краями, содержащий органоидные культуры.
- Перемещаясь с помощью микроманипулятора, нацельтесь иглой на один органоид. Расположите иглу близко к органоиду, а затем вставьте иглу в органоид одним быстрым движением. Введите примерно 0,2 мкл бактериального раствора в каждый органоид с помощью микроинъектора.
3. Собирайте органоиды для любого анализа.
- Например, закрепите органоиды через 4 ч. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл 2% формальдегида и инкубируйте 20 мин при RT или O/N при 4 °C. Органоиды можно обрабатывать для иммуногистохимии в соответствии со стандартными процедурами.