Оценка внутриклеточного роста мутантов Coxiella в клетках эукариот

Аннотация

Источник: Martinez, E. et al., Генерация и мультифенотипический скрининг с высоким содержанием транспозонных мутантов Coxiella burnetii.J. Vis. Exp.(2015)

Это видео демонстрирует метод оценки внутриклеточного роста мутантов Coxiella, меченных GFP, в культивируемых эпителиальных клетках. Мутантный фенотип визуализируется с помощью иммуноокрашивания и эпифлуоресцентной микроскопии, что позволяет изучить влияние мутации на внутриклеточный рост.

Протокол

1. Генерация библиотеки зеленого флуоресцентного белка, GFP-меченых мутантов транспозона Coxiella

Манипулируйте Coxiella burnetii RSA439 NMII в зоне биобезопасности уровня 2 (BSL-2) в шкафу микробиологической безопасности (MSC) в соответствии с местными правилами. Если это совместимо с используемой бактериальной моделью, повторите шаги с 1.4.1 по 1.4.4 для увеличения вероятности получения клональных мутантов. Типичная библиотека мутантов состоит (как минимум) из числа мутантов, которое в три раза превышает число кодирующих последовательностей, аннотированных в геноме используемого организма.

1. Приготовление электрокомпетентной Coxiella RSA439 NMII:
   1. Приготовьте 1x подкисленный цитрат цистеина среда-2 (ACCM-2): 13,4 мМ лимонной кислоты, 16,1 мМ цитрата натрия, 3,67 мМ фосфата калия, 1 мМ хлорида магния, 0,02 мМ хлорида кальция, 0,01 мМ сульфата железа, 125,4 мМ натрия хлорида, 1,5 мМ L-цистеина, 0,1 г/л бакто неопептона, 2,5 г/л казаминокислот, 1 г/л метилбета-циклодекстрина, 125 мл/л Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI). Отрегулируйте pH до 4,75 и простерилизуйте фильтр (не автоклавируйте).
      заметка: Жидкий ACCM-2 стабилен при 4 °C в течение примерно 1 месяца.
   2. Инокулируйте 100 мл ACCM-2 с 2 x 10 6-геномным эквивалентом (GE)/мл Coxiella RSA439 NMII (из ранее полученного бактериального запаса и количественно определенного, как на шаге 1.5) из запасов при температуре -80 °C и распределите бактериальную суспензию по колбам с² клеточными культурами диаметром 75 см с вентилируемыми крышками (10 - 15 мл бактериальной суспензии на колбу). Выращивайте в течение 7 дней при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержанием 5% углекислого газа (CO₂) и 2,5% кислорода (O₂).
   3. Полученную бактериальную суспензию разложите по 50 мл в пробирках и центрифугируйте при давлении 3900 x g в течение 1 часа при 4 °C.
   4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 30 мл 10% глицерина. Центрифуга при давлении 3 900 x g в течение 1 часа при 4 °C.
   5. Ресуспендируйте гранулу в достаточном объеме 10% глицерина (обычно 2 мл) и аликвоте 50 мкл в пробирках по 500 мкл. Держите ресуспендированные бактерии на льду в течение всего процесса.
      заметка: На этом этапе бактерии электрокомпетентны, и одной аликвоты достаточно для выполнения одной электропорации. Бактериальные суспензии можно хранить при температуре -80 °C в течение 6 месяцев или непосредственно использовать для электропорации плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
2. Электропорация компетентных Коксиелл с транспозон- и транспозаза-кодирующими плазмидами:
   1. Предварительно охладите электропорационную кювету 0,1 см в течение 10 минут на льду. Смешайте 50 μл электрокомпетентной Coxiella с 10 μг транспозонной плазмиды и 10 μг транспозазы. Убедитесь, что концентрация плазмид превышает 500 мкг/мл, чтобы свести к минимуму разбавление глицерина.
   2. Электропорировать с использованием следующей конфигурации: 18 кВ, 500 Ω, 25 мкФ. Убедитесь, что результирующая постоянная времени составляет от 9 до 13 мс.
   3. Немедленно добавьте 950 μл RPMI, повторно суспендируйте электропорированные бактерии и переложите в пробирку с завинчивающейся крышкой и держите при комнатной температуре.
   4. Возьмите 200 μл электропорированных бактерий и добавьте 3 мл ACCM-2 с добавлением 1% термоинактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в 6-луночные планшеты. Добавьте 88 μл диметилсульфоксида (ДМСО) к оставшемуся объему электропорированных бактерий (для достижения конечной концентрации 10% ДМСО) и храните при температуре -80 °C.
      Примечание: для следующего протокола транспонируемый элемент и транспозаза кодируются двумя различными плазмидами (pITR-CAT-GFP и pUC19-Himar1C9, соответственно). Обе плазмиды не имеют специфичного для Коксиеллы источника репликации, что делает их плазмидами самоубийства при электропорации в Коксиелле. Это обеспечивает стабильное введение транспозонов. Переносимый элемент содержит кассету с резистентностью к хлорамфениколу в соответствии с регуляцией промотора Coxiella p1169 для отбора и ген gfp в соответствии с регуляцией промотора Coxiella p311 для маркировки сгенерированных мутантов GFP.
3. Выбор транспозонных мутантов:
   1. Инкубируют 6-луночные планшеты, инокулированные, как описано выше (1.2.4), в течение ночи при 37 °C во влажной атмосфере с содержанием 5%_CO2 и 2,5%_O2. Добавьте соответствующие антибиотики (375 мкг/мл канамицина или 3 мкг/мл левомицетина). Инкубируйте бактериальную культуру в течение 3 дополнительных дней в условиях, описанных выше.
4. Выделение отдельных мутантов:
   1. Получение твердых пластин ACCM-2 и гальванизация мутантов транспозона Coxiella
      заметка: Следующие инструкции относятся к 1 чашке Петри, необходимо протестировать несколько разведений бактериальных культур, чтобы оценить оптимальный объем инокуляции для выделения колонии.
      1. Нагрейте 10,5 мл 0,5% агарозы в микроволновой печи и дайте ей остыть на водяной бане при температуре 55 °C. Нагрейте 11,25 мл 2x ACCM-2 (pH 4,75) до 37 °C.
      2. Подготавливаем донную агарозу:
         1. Смешайте 10 мл растопленной 0,5% агарозы с 10 мл 2x ACCM-2 и добавьте соответствующие антибиотики (375 мкг/мл канамицина или 3 мкг/мл левомицетина).
         2. Выливаем сразу в чашку Петри. Держите чашку Петри без крышки, дайте среде остыть в течение 30 минут и высушите на воздухе в течение 20 минут.
      3. Готовим верх агарозы:
         1. Смешайте 1,25 мл 2x ACCM-2 с 0,75 мл воды в полистирольной пробирке объемом 5 мл, добавьте соответствующие антибиотики (375 мкг/мл канамицина или 3 мкг/мл хлорамфеникола) и инкубируйте при 37 °C.
         2. Добавьте бактериальную культуру (обычно от 1 до 100 мкл) и перемешайте в течение 5 секунд.
         3. Добавьте 0,5 мл растопленной агарозы, перемешайте, и сразу же вылейте на дно агарозу.
         4. Дайте остыть в течение 20 минут, закройте крышкой чашку Петри и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 20 минут, чтобы способствовать затвердеванию агарозы.
         5. Сушка на воздухе в течение 20 минут без крышки в MSC. Выращивайте пластины при температуре 37 °C во влажной атмосфере 5%_CO2 и 2,5%_O2 в течение 6-7 дней.
   2. Добавьте ДМСО к оставшимся бактериальным культурам до достижения конечной концентрации 10% ДМСО и храните при температуре -80 °C.
   3. Оцените оптимальное разведение следующим образом: убедитесь, что колонии имеют диаметр от 0,5 до 1 мм и правильно изолированы, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Разморозьте оставшиеся бактериальные культуры из пункта 1.4.2 и нанесите в планшет соответствующее разведение на агаре ACCM-2, как описано в пунктах 1.4.1.2 и 1.4.1.3. Инкубировать в течение 6–7 дней, как описано в пункте 1.4.1.3.5.
   4. Как только колонии станут обнаруживаемыми, соберите их, разрезав конец наконечника объемом 1 мл, выбрав пробку, содержащую изолированные колонии, и диспергируйте колонию путем пипетирования в 1,5 мл ACCM-2, содержащего соответствующие антибиотики (375 мкг/мл канамицин или 3 мкг/мл хлорамфеникола) в 24-луночном планшете. Амплифицируйте отдельные колонии в течение 6 дней в условиях, описанных в. 1.3.1. На 3-й день инкубации рассейте бактериальные комки, пипетируя каждую культуру.
   5. Храните каждую мутантную суспензию в 2D-пробирках со штрих-кодом в 96-луночных планшетах с 10% ДМСО при -80 °C.
5. Оценка концентрации бактерий:
   заметка: Следующий протокол может быть применен для получения кривых роста бактериальных мутантов, реплицирующихся в аксенической среде (см. 1.4.4).
   1. Подготовка стандартной кривой:
      1. Приготовьте стоковый раствор двухцепочечной ДНК (дцДНК) (обычно случайной плазмиды известного размера и концентрации) 2 мкг/мл в 1x триэтилендиаминтетрауксусной кислоте, ЭДТА (ТЭ). Приготовьте 10-кратные серийные разведения из исходного раствора для получения концентраций от 2 мкг/мл до 2 нг/мл. Распределите по 50 мкл каждой концентрации в одиночные лунки 96-луночного микропланшета с черными стенками и дном (см. Таблицу материалов).
      2. Разбавьте реагент для количественного определения дцДНК в соотношении 1:200 в 1x TE буфере и добавьте 55 мкл разбавленного реагента в каждый образец в 96-луночном микропланшете. Хорошо перемешайте с помощью шейкера и выдерживайте от 2 до 5 минут при комнатной температуре в темноте.
      3. Измерьте флуоресценцию образцов с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера и фильтров для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждение ~480 нм, излучение ~520 нм).
      4. Построение графика диапазона концентраций плазмид в зависимости от показаний интенсивности флуоресценции.
   2. Количественное определение бактериальной суспензии:
      1. Дозируйте 5 мкл 10% Triton X-100 на лунку в 96-луночный микропланшет с черными стенками и дном (см. Таблицу материалов). Добавьте по 50 мл бактериальной суспензии в каждую лунку и выдерживайте в течение 10 минут при комнатной температуре на вибростенде.
      2. Разбавьте реагент для количественного определения дцДНК в соотношении 1:200 в 1x TE буфере и добавьте 55 мкл разбавленного реагента в каждый образец в 96-луночном микропланшете. Хорошо перемешайте с помощью шейкера и выдерживайте от 2 до 5 минут при комнатной температуре в темноте.
      3. Измерьте флуоресценцию образцов с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера и фильтров для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждение ~480 нм, излучение ~520 нм).
      4. Чтобы получить концентрацию бактериальной ДНК, нанесите показания флуоресценции на диаграмму, полученную в пункте 1.5.1.4. Разделите концентрацию ДНК на массу генома Coxiella (2,2 fg), чтобы получить бактериальные концентрации. Экспресс-результаты в эквиваленте генома/мл.
      5. Отбросьте мутантов со значительным дефектом роста в ACCM-2.

2. Монопраймерная колоний-полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование и аннотация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для амплификации ДНК 96 образцов, для следующих этапов рекомендуется использовать многоканальную пипетку. Колоночная очистка продуктов ПЦР с использованием магнитных шариков и секвенирование ДНК с помощью транспозон-специфичного праймера (2.3) поручается сторонней компании.

1. Убедитесь, что амплификационный праймер спроектирован таким образом, чтобы гибридизировать от 100 до 200 пар оснований перед инвертированным тандемным повтором (ITR) для получения продуктов ПЦР, покрывающих сайт вставки транспозона в геноме Coxiella. Приготовьте 3 мл ПЦР-смеси (1x буфер высокой точности, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфат (dNTP), 1 мкМ праймер амплификации, 20 ед/мл высокоточной ДНК-полимеразы) и распределите 29 мкл на лунку в 96-луночном ПЦР-планшете, установленном на льду. Перенесите по 1 мкл каждого мутанта в стационарной фазе в ACCM-2 в смесь для ПЦР.
2. Провести ПЦР с начальной денатурацией (98 °C, 1 мин), 20 циклов высокой жесткости (98 °C, 10 сек; 50 °C, 30 сек; 72 °C, 90 сек), 30 циклов низкой жесткости (98 °C, 10 сек; 30 °C, 30 сек; 72 °C, 90 сек) и 30 циклов высокой жесткости (98 °C, 10 сек; 50 °C, 30 сек; 72 °C, 90 сек) с последующим окончательным продлением при 72 °C в течение 7 мин.
3. Очистите продукты ПЦР с помощью магнитных шариков и секвенируйте ДНК с помощью транспозон-специфичного праймера. Спроектируйте специфичный для транспозона праймер с прогнозируемой температурой плавления, составляющей от 50°С до 75°С, содержанием GC от 40% до 60%, длиной от 18 до 25 нуклеотидов, и сайтом отжига после сайта гибридизации амплификационного праймера и, по меньшей мере, 100 парами оснований выше первой пары оснований транспозона ITR.
4. Используя программное обеспечение для анализа последовательностей, загрузите полный аннотированный геном Coxiella burnetii 493 NMI. Используйте функцию "align to reference" для загрузки и выравнивания (blastn) результатов секвенирования и определения места транспонирования. Отбрасывайте мутантов с несовпадающими и/или отображающими двойное чтение. Чтобы контролировать насыщенность библиотеки мутантов, ведите учет возникновения множественных вставок транспозонов в одном и том же сайте.

3. Испытание эукариотическими клетками с мутантами Coxiella и мониторинг внутриклеточного роста

ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальный пипетка рекомендуется использовать для следующих этапов. Инфекции выполняли в трех экземплярах в стерильных 96-луночных микропланшетах с черными стенками и плоским прозрачным дном. wt Coxiella burnetii, экспрессирующая GFP, была предоставлена доктором Робертом Хайнценом.

1. Выращивайте клетки Vero в RPMI без фенола красного с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в отсутствие антибиотиков (Complete RPMI media).
2. За день до заражения промойте клетки Vero из колбы для конфлюентных или субконфлюентных клеточных культур 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
3. Отделите клетки Vero путем добавления 1 мл раствора трипсина ЭДТА в колбу для клеточных культур и инкубируйте в течение 3-5 минут при 37 °C во влажной атмосфере с содержанием 5%_CO2.
4. Ресуспендируйте клетки в 10 мл полной среды RPMI. Подсчитайте клетки и приготовьте клеточную суспензию из 10⁵ клеток на мл.
5. Дозируйте по 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку черного 96-луночного планшета с плоским прозрачным дном.
6. Центрифугируйте в течение 5 мин при 400 x g при комнатной температуре (RT) для облегчения адгезии клеток на дне лунок и инкубируйте в течение ночи при 37 °C во влажной атмосфере с содержанием 5%_CO2.
7. Разморозьте 96-луночные планшеты, содержащие мутанты Coxiella, при ОТ и разведите 150 мкл бактериальной суспензии в 300 мкл RPMI без фенолового красного и FBS в глубокой лунке 96-луночного планшета.
8. Удалите среду из микропланшета, содержащего клетки Vero, и диспенсируйте 100 мкл/лунку разбавленных мутантов Coxiella (MOI 100). Используйте лунки А1 в качестве отрицательного (неинфицированные клетки) контроля и лунки А2 и А3 в качестве положительного контроля (клетки, инфицированные wt Coxiella, экспрессирующие GFP при кратности инфекций (MOI) 100 и 200).
9. Центрифугируйте планшет в течение 10 минут при 400 x g при RT с помощью аэрозоленепроницаемого держателя центрифуговой пластины.
10. Инкубировать при 37 °C во влажной атмосфере с концентрацией 5%_CO2 в течение 2 часов, затем заменить среду, содержащую бактерии, на 100 μл/лунку свежей, полной среды RPMI.
11. Измеряйте флуоресценцию GFP каждый день в течение 7 дней с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера и фильтров для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждение ~480 нм, излучение ~520 нм). Во избежание помех из-за конденсации и дисперсии сигнала в питательной среде используйте регистрацию донного возбуждения и излучения на считывателе микропланшетов.

4. Подготовка образцов для автоматического получения изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура заключается в том, чтобы для одного 96-луночного планшета соответственно увеличить объемы. В шагах из пункта 4.2 может быть использована шайба для пластин.

1. На^7-й день после заражения удалите среду из планшета и замените ее 50 мкл/лунку свежей, полной среды, содержащей проницаемый для клеток флуоресцентный краситель в соответствующем разведении (обычно 1:1000, оптимизируется в соответствии с используемой клеточной линией). Инкубировать клетки в течение 30 - 60 минут при 37 °C во влажной атмосфере с содержанием_CO2 5%.
2. Замените среду на 50 мкл/лунку с содержанием 4% параформальдегида (PFA) в PBS, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (RT), затем удалите PFA-содержащий буфер и промойте PBS 3 раза.
3. Удалите PBS и дозируйте 50 μл/лунку блокирующего раствора (0,5% бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ хлорида аммония, NH₄Cl в PBS, pH 7,4) с добавлением 0,05% сапонина. Инкубировать при RT в течение 30 минут.
4. Замените блокирующий раствор 40 μл/лунку свежего блокирующего раствора с добавлением сапонина (как указано выше) и антителом против лизосом-ассоциированного мембранного гликопротеина-1 (анти-LAMP1) в разведении 1:500. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при RT.
5. Удалите блокирующий раствор и промойте 96-луночный планшет 5 раз 100 μл/лунка PBS.
6. Дозируйте 40 мкл/лунку блокирующего раствора с добавлением сапонина (как указано выше), соответствующее флуоресцентно меченное вторичное антитело (в разведении 1:1000) для выявления антитела против LAMP1, примененное на стадии 4.4, и с помощью Hoechst 33258 в дозе 5 мкг/мл. Инкубируйте в течение 30 мин в режиме ЛТ.
7. Удалите блокирующий раствор и промойте 96-луночный планшет 5 раз 100 μл/лунка PBS. Оставьте в 96-луночной пластине объем PBS, соответствующий последней промывке, так как неподвижные ячейки не должны пересыхать.
8. Немедленно сфотографируйте пластину или храните пластину при температуре 4 °C в защищенном от света месте для последующего анализа.

5. Получение изображений

1. Получайте изображения в каналах GFP (488 нм, бактерии), Hoechst 33258 (350 нм, ядра клетки-хозяина), красном (~555 нм, маркер клеточной мембраны) и дальнем красном (~615 нм, LAMP1) каналах с помощью эпифлуоресцентного автоматического микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом. Получите 21 независимое поле на лунку, чтобы получить изображение не менее 5 000 клеток в образце. Примените автофокусировку, используя канал ядра клетки-хозяина в качестве эталона. При работе с бактериальными патогенами, инфицирующими низкий процент клеток-хозяев, пользователи могут регулировать количество независимых полей, визуализируемых в каждой лунке, чтобы получить минимум 500 инфицированных клеток для анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
лимонная кислота	сигма	С0759-500Г	Средний компонент ACCM-2
Цитрат натрия	сигма	С4641-500Г	Средний компонент ACCM-2
Фосфат калия	сигма	60218-100Г	Средний компонент ACCM-2
Хлорид магния	сигма	М2670-100Г	Средний компонент ACCM-2
Хлорид кальция	сигма	С5080-500Г	Средний компонент ACCM-2
Железный купорос	сигма	Ф8633-250Г	Средний компонент ACCM-2
Хлорид натрия	сигма	С9625-500Г	Средний компонент ACCM-2
L-цистеин	сигма	С6852-25Г	Средний компонент ACCM-2
Бакто Неопептон	BD (Бектон-Дикинсон)	211681	Средний компонент ACCM-2
Казаминокислоты	BD (Бектон-Дикинсон)	No 223050	Средний компонент ACCM-2
Метил-В-циклодекстрин	сигма	С4555-10Г	Средний компонент ACCM-2
RPMI с глутамаксом	Gibco	No 61870-010	Средний компонент ACCM-2
RPMI с глутамаксом, без фенола красного	Gibco	32404-014 (Английский)	Для культивирования клеток и инфицирования
Фетальная бычья сыворотка	GE Healthcare	SH30071	Для культивирования клеток
Трипсин ЭДТА (0,25%)	Технологии Life	No 25200-056	Для культивирования клеток
сапонин	сигма	47036	Для иммунофлуоресцентного окрашивания
нашатырь	сигма	А9434	Для иммунофлуоресцентного окрашивания
Бычья сыворотка альбумин	сигма	А2153	Для иммунофлуоресцентного окрашивания
Кювета для электропорации 0,1 см	Eurogentec	КЭ0001-50	Для трансформации Coxiella
Trackmates винтовые верхние трубы с колпачками	Термо Сайентиал	No 3741	2D завинчивающаяся крышка со штрих-кодом
96-луночный микропланшет с черными стенками и дном	Грейнер	655076	Плоское темное дно, для количественного определения дцДНК
96-луночный микропланшет, прозрачные, черные стенки	Грейнер	Номер 655090	Плоское прозрачное дно, для культивирования клеток и визуализации
96-луночный микропланшет для ПЦР	Биорад	2239441	ДНКаза свободна
96-луночная пластина, Deepwell	Лабкон	949481	Для инфекций, вызванных мутантами Coxiella
ПикоГрин	Технологии Life	П7581	Для количественного определения дцДНК
Тритон Х-100	сигма	Т9284-500МЛ	Для количественного определения дцДНК
Phusion Высокоточная ДНК-полимераза	Биолаборатории Новой Англии	М0530Л	Для ПЦР с колонией одиночного праймера
Сотовый трекер Red CMTPX	Технологии Life	С34552	Для визуализации
Антитела Anti-LAMP1	сигма	94403-1МЛ	Для иммунофлуоресцентного окрашивания
Хёхст 33258	сигма	Л1418	Для визуализации
Флуоресцентный считыватель микропланшетов Infinite 200 Pro	Текан
Эпифлуоресцентный автоматизированный микроскоп Cellomics	Термо Сайентиал