Следующие протоколы описывают методы культивирования и изучения инвазии анаэробного вида P. gingivalis; однако, эти протоколы могут быть использованы для ряда анаэробных патогенов. Несмотря на то, что используются HUVECs, этот протокол может быть использован для других эукариотических клеток, как иммунных, так и неиммунных.
1. Использование и обслуживание анаэробной камеры
Примечание: P. gingivalis - это анаэроб, чувствительный к нормальному уровню кислорода, встречающегося в окружающем воздухе. Контролируемая анаэробная среда жизненно важна для культивирования P. gingivalis.
- Здесь поддерживается искусственная атмосфера, обозначенная как смешанный анаэробный газ (80% N2, 10% H2, 10% CO2) в виниловой анаэробной камере (Рисунок 1A). Используйте шлюзовую камеру (рис. 1B) для переноса предметов из лабораторной среды в анаэробную камеру. Воздушный шлюз работает вручную, дважды продуваясь газом N2 перед введением смешанного анаэробного газа.
- Используйте колонку для удаления сероводорода (Рисунок 1C) для удаления нежелательного сероводорода, не требующего технического обслуживания. Поместите осушитель воздуха в камеру, чтобы удалитьH2O, образующийся в результате действия катализатора, и избежать попадания аэрозолей, способствующих распространению загрязнения.
заметка: Сероводород является естественным побочным продуктом метаболизма многих анаэробных бактерий, и его накопление токсично для бактерий и может привести к повреждению электроники и сокращению срока службы катализатора.
- Используйте вентиляторную коробку для циркуляции атмосферы камеры через палладиевый катализатор, который удаляет кислород в присутствии водорода (рис. 1D).
Примечание: Рециркуляционный атмосферный фильтр (высокоэффективный воздушный фильтр твердых частиц или HEPA) удаляет загрязняющие вещества из воздуха размером 0,22 мкм или более.
- Культивируйте анаэробные бактерии в инкубаторе с температурой 37 °C, который находится внутри анаэробной камеры. Используйте стандартные асептические техники при работе внутри анаэробной камеры.
2. Получение анаэробных бактерий
Примечание: P. gingivalis является аэротолерантным и может храниться в аэробных условиях, но он не будет расти в присутствии кислорода на уровнях выше 6%. Анаэробная камера необходима для правильного выращивания P. gingivalis и других анаэробных видов (рис. 1). Перед работой с микроанаэробами требуется надлежащая подготовка и обучение использованию анаэробной камеры.
- Уравновесьте все жидкие среды и планшеты до анаэробных условий в течение не менее 12 часов перед экспериментом, чтобы удалить остаточный кислород.
- Перенесите P. gingivalis из морозильной камеры при температуре -80 °C в анаэробную камеру и дайте оттаять.
- Полоса P. gingivalis на агаровых пластинах триптиказы из соевой крови (TSA II с 5% овечьей крови). Оберните пластины в парапленку и храните при температуре 37 °C в анаэробном инкубаторе в течение 4-7 дней.
- Инокулируйте P. gingivalis в 3 мл инфузионного бульона мозга и сердца (BHI) с добавлением гемина и менадиона, обогащенной неселективной жидкой среды для выделения и культивирования анаэробных и привередливых микроорганизмов, используя стерильные петли.
заметка: Для длительного хранения смешайте бактериальные культуры, приготовленные в BHI, с глицерином или ДМСО (конечная концентрация 10-20%) и поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C.
- Приготовьте закваску P. gingivalis, сделав разведение в соотношении 1:10 и позволив бактериям расти до фазы среднего логарифма.
Примечание: Определяется оптическая плотность бактериальной суспензии и корректируется бактериальная концентрация для каждого исследуемого штамма. Для P. gingivalis суспензия при наружном диаметре660 0,7 соответствует среднелогарифмической фазе и ~7 х 108 клеток/мл. Условия роста, описанные в приведенном выше протоколе, специфичны для P. gingivalis и, возможно, потребуется адаптировать к другим бактериальным штаммам.
3. Культура эндотелиальных клеток
Примечание: Приобретите объединенные первичные HUVEC и культуру в базальной среде, содержащую факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) при 37 °C в 5% CO2 в соответствии с инструкциями производителя.
- Затравите HUVECs в колбах T-75 по2,5 x 10 5 клеток/колбу в среде VEGF 15 мл.
заметка: Проверьте жизнеспособность с помощью разведения 1:1 с 4,0% трипановым синим. Клетки с поврежденной мембраной сохраняют трипановый синий, а здоровые клетки с неповрежденными мембранами будут казаться белыми при рассмотрении под бинокулярным световым микроскопом. Подсчитайте 100 клеток и убедитесь, что более 80% клеток жизнеспособны.
- Заменяйте среды каждые 2 дня предварительно подогретыми свежими средами VEGF до тех пор, пока клетки не достигнут ~80% конфлюенции.
- Промойте клетки один раз предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS). Освободите клетки из колбы Т75 путем инкубации с 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в течение 5 мин с последующим вводом 2 мл нейтрализующего раствора трипсина.
- Соберите взвешенные HUVEC в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте все лишние ячейки из колб Т-75 с помощью PBS и переложите в конические пробирки объемом 50 мл.
- Центрифугируйте ячейки при плотности 200 x g в течение 10 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и суспензируйте клеточную гранулу в 10 мл предварительно подогретой среды VEGF.
- Определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или аналогичного устройства для подсчета клеток.
- Рассчитайте количество суспензии ячеек для добавления либо в 6-луночный планшет (400 000 на лунку), либо на 12-луночный планшет с покровными стеклами (50 000 на лунку). HUVEC будут готовы к экспериментам на следующий день.
4. Инвазия/взаимодействие с анализом выживания (покрытие)
Примечание: При выполнении этого анализа приготовьте две 6-луночные пластины эндотелиальных клеток, засеянных в 400 000 клеток/лунку. Один планшет будет использоваться для оценки бактерий, прикрепленных к клеткам-хозяевам и интернализованных ими. Другая пластина будет отвечать за внутриклеточные бактерии. Планшет с 6 лунками позволяет выполнять тройные тесты из двух образцов в одном эксперименте. Краткое описание этого протокола приведено в блок-схеме анализа выживаемости (Рисунок 2).
- Подготавливайте анаэробные бактерии, как описано выше (см. раздел 1), пока они не достигнут среднего логарифмического роста (наружный диаметр660 0,5-0,7).
- Центрифугирование бактерий при давлении 5 000 x g в течение 10 мин.<бр/>
Примечание: Если центрифуга находится за пределами анаэробной камеры, переносите бактериальные образцы в плотно закрытой пробирке объемом 15 мл и оберните крышку парапленкой для предотвращения утечки кислорода.
- Поместите гранулированный P. gingivalis обратно в камеру и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте PBS и еще раз измельчите гранулированные бактерии перед повторной суспензией в среде VEGF. Приготовьте суспензии для всех штаммов бактерий, подлежащих испытанию, при наружном диаметре660 0,7, что соответствует среднелогарифмической фазе (~7 x 10,8 клеток/мл). Теперь бактерии готовы к заражению.
- Перенесите 6-луночные планшеты, содержащие HUVEC, из инкубатора для тканевых культур в анаэробную камеру. Удалите среду и трижды промойте анаэробным PBS. Добавьте 2 мл анаэробной среды VEGF в каждую лунку и поместите планшеты при температуре 37 °C в анаэробный инкубатор на 20 минут, чтобы выровнять температуру для инфекции><.
заметка: Пластинчатые бактерии на кровяных агаровых пластинах, чтобы убедиться, что бактерии, используемые для инфекции, однородны и не загрязнены при заражении.
- Заражать клетки-хозяева бактериями при кратности инфекции (бактерии MOI: хозяин) 100:1,
заметка: Количество клеток HUVEC определяется путем проведения теста на исключение трипана в одной лунке перед инфекцией. Количество бактериальных клеток определяется по оптической плотности (например, OD 0,5 = 5 x 108 клеток/мл). Концентрация бактерий регулируется в соответствии с правильным MOI на основе концентрации HUVEC.
- Поместите 6-луночные планшеты с инфицированными HUVEC в анаэробный инкубатор и дайте бактериям взаимодействовать с клетками хозяина в течение 30 минут.
- Приготовьте сапонин в BHI (1,0% мас./об.) внутри анаэробной камеры и отфильтруйте через фильтр 0,2 мкм.
- Выживание как прикрепленных, так и внутренних бактерий.
- Достаньте пластины из инкубатора, аспирируйте среды, трижды промойте анаэробным ПБС, и добавьте 2 мл фильтрованного 1,0% сапонина (приготовленного так, как описано в пункте 4.8). Инкубируйте в течение 15 минут, чтобы обеспечить лизис клетки-хозяина.
- Соскребите дно каждой лунки скребком для ячеек. Соберите клеточную смесь из каждой лунки и сделайте разведение BHI в соотношении 1:1.
- Приступайте к серийным разведениям пробы. В зависимости от вида и концентрации бактерий корректируйте серийные разведения. Начните с разведения 1:100 или 1:1,000.
- Планшет 200 мкл желаемого разведения на кровяных агаровых пластинах. Оберните пластины парапленкой и поместите их в анаэробный инкубатор при температуре 37 °C.
- После семи дней инкубации при 37 °C снимите планшеты и подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) с помощью лайтбокса для ручного подсчета колоний.
заметка: Перечислены КОЕ. Для больших количеств КОЕ могут быть сделаны снимки и использовано компьютерное программное обеспечение для облегчения подсчета КОЕ.
