$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Интернализация бактерий в клетки-хозяева (флуоресцентная микроскопия)
Примечание: P. gingivalis помечен 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(и-6)-карбоксифлуоресцеином, ацетоксиметиловым эфиром (BCECF-AM). BCECF-AM представляет собой нефлуоресцентный мембранопроницаемый краситель; его превращение в флуоресцеин BCECF под действием внутриклеточных эстераз может указывать на жизнеспособность клеток. P. gingivalis мечется красителем BCECF-AM, а затем используется для инфицирования эукариотических клеток. После инфицирования клетки фиксируются и помечаются DAPI и TRITC-фаллоидином. Краситель DAPI, используемый для окрашивания ядра эукариотической клетки, также будет помечать ядро бактериальной клетки, что обеспечивает контрмеру для идентификации нежизнеспособных бактерий, которые не могут метаболически расщеплять BCECF-AM. Клетки-хозяева выделяются TRITC-фаллоидином, красным актиновым красителем.
- Автоклавные покровные стекла. Асептически добавляйте покровные стекла в 12-луночные планшеты перед посевом эндотелиальных клеток в соотношении 5 x 104 клеток/лунку. (Подготовлено за день до эксперимента)
- Подготовьте эндотелиальные клетки на круглых покровных стеклах диаметром 18 мм (толщина #1,5) в 12-луночных планшетах, как описано выше.
- Готовят анаэробные бактерии, выращенные до среднелогической фазы (ОД660 = 0,5-0,7).
- Промойте бактерии 2x анаэробным PBS центрифугированием при 5 000 x g и суспендированием гранулы в PBS при 5-7 x 108 клеток/мл.
- Добавьте 20 мкл 0,2 мМ BCECF-AM к 2 мл бактериальной суспензии (5-7 x 108 клеток/мл) до конечной концентрации BCECF-AM 2 μМ.
- Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут в темноте.
- Перенесите планшеты с эндотелиальными клетками, засеянными на круглые покровные стекла толщиной 18 мм (толщина #1,5), из инкубатора для тканевых культур в анаэробную камеру. Промывка PBS и замена на анаэробную среду VEGF.
Примечание: Убедитесь, что HUVEC здоровы под световым микроскопом. HUVECS должен быть на ~80% сливающимся, морфология должна быть сопоставима с производителями.
- Центрифугируйте меченые бактерии при давлении 5 000 x g в течение 10 минут, чтобы удалить остатки красителя BCECF-AM. Суспендировать в 2 мл анаэробной среды VEGF.
- Заражайте клетки-хозяева мечеными бактериями при MOI 100:1 (бактерии: хозяин).
- Инкубировать в анаэробной камере при температуре 37 °C в течение 30 минут.
- После заражения клетки трижды промыть ПБС и закрепить в свежеприготовленных 4,0% параформальдегиде на 10 мин.<бр/>
заметка: После фиксации клеток эксперименты можно проводить за пределами анаэробной камеры.
- Промойте покровные листы PBS три раза.
- Добавьте 1 мл 0,2% Triton X-100 на 10 минут.
- Промойте покровные листы PBS три раза.
- Добавьте 50 μл фаллоидина TRITC (50 μг/мл) в покровные стекла на 45 минут.
- Промойте покровные стекла три раза, снимите их с 12-луночной пластины и поместите на предметное стекло с мягко фиксируемым монтажным материалом, содержащим DAPI. Заклейте бока лаком для ногтей.
заметка: Предметные стекла могут храниться в течение нескольких месяцев в темноте. Избегайте воздействия света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
- Просматривайте слайды с помощью конфокального микроскопа.
- Здесь используется 34-канальная спектральная система (32-канальный матричный детектор и два боковых детектора ФЭУ, а также детектор проходящего света), сконфигурированная вокруг стенда AxioObserver (перевернутого) с моторизованным XY-столиком. Система имеет пять лазеров: синий диод (405 нм), многолинейный аргон (458, 488, 514 нм), зеленый диод (561 нм), красный HeNe (633 нм) и импульсный лазер 440 нм. Оснастить систему флуоресцентной визуализации в течение всего срока службы 2 гибридными детекторами GaAsP (для FRET-FLIM).
- Детектирование флуоресценции от DAPI и TRITC в одном канале с помощью двухполосного фильтра с длинами волн возбуждения 340-380 нм и 540-560 нм и эмиссионным фильтром 435-485 нм и 570-590 нм соответственно. Определение флуоресценции от BCECF-AM с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 440-500 нм и эмиссионным фильтром 510-590 нм.<бр/>
заметка: Контроль BCECF-AM должен быть проведен для каждого изучаемого штамма бактерий, чтобы обеспечить надлежащую маркировку жизнеспособных бактерий. Во-первых, убедитесь, что нежизнеспособные бактерии являются DAPI-положительными и BCECF-отрицательными. Во-вторых, убедитесь, что живые бактерии могут метаболизировать BCECF-AM во флуоресцеин BCECF. Для оптимальной маркировки может потребоваться тестирование переменных концентраций бактерий или красителя BCECF-AM.