Оценка киллерной активности опсонофагоцитов в отношении бактериальных патогенов

Аннотация

Источник: Paschall, A. V. et al., Анализ убийства опсонофагоцитов для оценки иммунологических реакций против бактериальных патогенов.J. Vis. Exp.(2019)

Видео показывает анализ in vitro на убийство опсонофагоцитов с использованием совместной культуры человеческих нейтрофилов с Streptococcus pneumoniae. Антитела и белки комплемента облегчают опсонизацию бактерий, позволяя нейтрофилам распознавать и убивать бактерии, демонстрируя успешную опсонофагоцитарную активность нейтрофилов.

Протокол

1. Культивирование, дифференцировка и валидация клеток HL-60

1. Приготовьте среду для культивирования клеток HL-60, состоящую из 500 мл Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) с L-глутамином и 50 мл термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки. Не добавляйте антибиотики, так как это может повлиять на дифференцировку клеток HL-60.
2. Для размножения/поддержания клеток HL-60 культивируйте 5 x 10⁶ клеток в 10 мл клеточных культуральных сред HL-60 в 75 см² вентилируемых колбах при 37 °C и 5% углекислом газе (CO₂). Пассаж клеток каждые 3−4 дня для поддержания оптимальных концентраций клеток.
   заметка: Концентрация клеток не должна превышать 5 х 10⁶/мл.
3. Создание рабочих запасов клеток HL-60 путем аликвотирования примерно 1 x 10⁶ клеток/мл в питательных средах HL60 с 10% диметилсульфоксидом (ДМСО) в 1 мл криогенных пробирок.
   заметка: Рабочие массы могут храниться при температуре -80 °C. Основной запас следует хранить при температуре -120 °C.
4. Дифференцировать клетки HL-60 путем культивирования 1,5 x 10⁷ клеток в 15 мл среды для культивирования клеток HL-60 с 0,6% N, N-диметилформамидом (DMF) при 37 °C и 5% CO₂ в стерильных колбах с фильтром 75 см² в течение 3 дней до опсонофагоцитарной киллерной активности (OPKA).
5. Подтвердить, что клетки HL-60 были успешно дифференцированы и пригодны для использования в анализе OPKA, путем тестирования маркеров жизнеспособности и клеточной поверхности в соответствии с установленными протоколами проточной цитометрии. После дифференцировки собирают клетки HL-60 и окрашивают примерно 1 x 10⁴ клетки флуоресцентно-конъюгированными антителами/красителями для CD71, CD35, аннексина V и йодида пропидия><. заметка: Дифференцированные клетки должны быть жизнеспособными на ≥65%, CD35⁺ на ≥55% и на ≤20% CD71⁺ в соответствии с установленными протоколами валидации (рис. 1).

2. Приготовление буферов и реагентов OPKA

1. Приготовьте 50 мл стерильного опсонизационного буфера B (OBB) путем смешивания 42,5 мл стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) с Ca²⁺/Mg²⁺, 5 мл инактивированной тепловой сывороткой плода крупного рогатого скота и 2,5 мл 0,1% стерильного желатина. Хранить при температуре 4 °C.
2. Приобретите прикорм для крольчат и храните при температуре -80 °C.
3. Получите или подготовьте бактериальные культуральные планшеты (т.е. 15 x 100 мм,² 5% агаровые пластины из овечьей крови).

3. Подготовка образцов бактериального материала

1. Получить запас штаммов бактерий, подлежащих испытанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола используется серотип 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, любезно предоставленный доктором Мун Намом).
2. Выращивайте штамм бактерий в подходящем бульоне (т.е. бульоне Тодда-Хьюитта + 0,5% дрожжевого экстракта для этого штамма WU2) в течение примерно 2−4 ч при 37 °C.
   заметка: Оптическая плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) культуры должна составлять от 0,6 до 0,8.
3. Гранулируйте бактерии центрифугированием при 6000 x g в течение 2 мин и повторно суспендируйте клетки в 10−30 мл 15% глицерина в соответствующем бульоне. Бактериальную культуру (500 мкл на аликвоту) переложить в стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и хранить при температуре -80 °C.
4. Разморозьте один флакон бактериального запаса на водяной бане при температуре 37 °C. Гранулируйте бактериальные клетки и ресуспендируйте в 500 мкл OBB в стерильных условиях.
5. Приготовьте различные разведения бактериального запаса в ОББ (т.е. 10 мкл без разбавления, 10 мкл 1:10, 10 мкл 1:100 и т.д.). Проведите анализ OPKA (разделы 4–6, включая кокультуру HL-60/комплемента), как описано ниже, используя различные разведения необработанного бактериального запаса. Закваливайте планшеты в течение ночи при температуре 30 °C (без_CO2).
   заметка: Температура 30 °C характерна для WU2 для предотвращения чрезмерного роста; другие штаммы/серотипы могут оптимально расти при 37 °C.
6. Подсчитайте колонии для каждого разведения необработанного бактериального фонда, совместно культивируемого с клетками HL-60 и комплементом. Определить, при каком разведении бактерий получается оптимальное количество счетных колоний (примерно 80−120 колониеобразующих единиц (КОЕ) для необработанных бактерий, совместно культивируемых с клетками HL-60). Обратите внимание на это разведение для будущих ОПКА с участием этого бактериального запаса.

4. Бактериальное лечение и культивирование

1. Разморозьте одну пробирку бактериального бульона, приготовленного на шаге 3.3. Гранулированные бактерии (6000 x g в течение 2 мин) и ресуспендируют клеточную гранулу в OBB при оптимальном разведении, как определено на шаге 3.6.
2. Пипетка 10 мкл ресуспендированного бактериального разведения на лунку в 96-луночном планшете для культивирования клеток с круглым дном.
3. Добавьте 20 μL соответствующего антитела или лекарственного препарата в каждую экспериментальную лунку в двух экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе серотип-специфическое антитело, полученное у мышей, добавляется в качестве лечения X, а фермент гликозидгидролаза, который, как известно, разрушает полисахаридную капсулу серотипа 3, добавляется в качестве лечения Y (Рисунок 2). Для контрольных скважин используйте 1x PBS или OBB, в зависимости от буфера, используемого для обработки скважин.
4. Встряхивайте планшет с образцом со скоростью примерно 90 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре. Регулируйте эти условия в зависимости от оптимальной температуры или условий встряхивания тестируемых обработок.

5. Бактериальная кокультура HL-60

1. Подготавливают клетки HL-60 путем забора дифференцированных клеток HL-60, обработанных DMF за три дня до этого (см. шаг 1.4), в конические пробирки объемом 15 мл. Гранулируйте клетки (500 г в течение 3 минут), выбросьте надосадочную жидкость и промойте не менее 10 мл 1x PBS.
2. Гранулируйте промытые клетки (500 x g, 3 мин), выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в OBB (начните с 1 мл OBB и отрегулируйте концентрацию до 1 x 10⁷ мл/мл после подсчета клеток).
3. Добавьте добавку для крольчат (стерильную, неразбавленную сыворотку для кроличьего ребенка, возраст 3−4 недели) в соотношении 1:5.
   заметка: Конечная концентрация смеси комплемента HL-60 должна составлять 1 x 10⁷/мл. При тестировании зависимости от комплемента можно использовать второй раствор, содержащий активные клетки HL-60 с термоинактивированным комплементом (комплемент можно инактивировать путем инкубации в водяной бане при температуре >55 °C в течение не менее 30 мин).
4. После завершения бактериологического культивирования через 1 ч (шаг 4.4) разделите каждый образец (т.е. 10 мкл из каждой лунки объемом 30 мкл в две новые лунки) на дублирующие лунки для двух групп (т.е. используйте только 20 мкл из исходных 30 мкл совместной культуры для учета ошибки пипетирования): один набор будет сокультивирован с HL-60-комплементом, а другой будет включать только бактерии. Добавить 50 мкл смеси HL-60-комплемента (с шага 5.3) в каждую экспериментальную комплектацию лунок (делегировано +HL-60); добавьте 50 мкл только OBB в лунки для бактерий (делегировано -HL-60).
   заметка: В данном примере для исходной кокультуры с 5 x 10⁵/50 μL клетками HL-60 используют примерно 800 бактериальных КОЕ. Если эта множественность инфекции слишком высока или слишком мала, как указано в окончательном количестве колоний, отрегулируйте исходное бактериальное разведение в отличие от количества клеток HL-60.
5. Встряхните 96-луночный планшет при температуре 37 °C в течение 1 ч (без CO₂).

6. Нанесение образцов и ночная инкубация

1. Разбавьте каждую лунку в соотношении 1:5 с помощью ОББ, так, чтобы каждый образец имел объем не менее 50 мкл.
2. Пипеткой 50 мкл каждого образца наносите непосредственно на отведенную область бактериального планшета, обеспечивая достаточное расстояние между образцами. Для 15 х 100 мм² круглых агаровых пластин пипетировать примерно 4 образца на одну пластину.
3. Накройте крышкой и дайте образцам высохнуть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.
4. Переверните планшеты и культуру на ночь при температуре 30 °C (без_CO2). В качестве альтернативы, культивируемые планшеты в анаэробных банках для проверки того, влияют ли бескислородные условия на рост бактерий или для контроля морфологии.
5. После ночного выращивания подсчитайте колонии в каждой отведенной для этого области. Анализируйте данные, сравнивая количество живых клеток в каждом наборе с соответствующим контролем и/или образцами, которые не получают кокультуру клеток HL-60 (что свидетельствует о 100% выживаемости клеток, 0% уничтожении клеток).

Результаты

Рисунок 1: Валидация дифференцировки клеток HL-60 с помощью проточной цитометрии.Дифференцированные клетки HL-60 собирали, промывали и ресуспендировали в PBS 1 x 10⁵ клеток/мл. Затем клетки аликвотировали в 12 лунок (100 мкл/лунка) в 96-луночном планшете. Затем клетки окрашивали флуоресцентно конъюгированными анти-CD35, анти-CD71, аннексином V и йодидом пропидия. В качестве контроля исполь...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аннексин V (APC сопряженный)	Биолегенда	640919
Анти-CD35, человеческий (ПЭ конъюгированный)	Биолегенда	333405
Анти-CD71, человеческий (ПЭ конъюгированный)	Биолегенда	334105
Используемый штамм бактерий (например, Streptococcus pneumoniae, WU2)	Бактериальная респираторная референс-лаборатория (д-р Мун Нам)
Кровяные агаровые пластины	Харди Диагностик	А10
Сыворотка для клонирования плода	ГиКлон	SH30080.03
глицерин	сигма	Г9012-1Л
Элементы HL-60	АТКС	СКЛ-240
Контроль изотипа IgG (PE конъюгированный)	Биолегенда	400907
N,N-диметилформамид (ДМФА)	Фишер Кемикал	ООН2265
Йодид пропидия	сигма	П4864
Среды RPMI с L-глютамином	Корнинг	10-040-CV