Оценка интернализованных Porphyromonas gingivalis в эндотелиальных клетках хозяина

Аннотация

Источник: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Evaluation Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем анализ для оценки выживаемости Porphyromonas gingivalis внутри эндотелиальных клеток человека. Мера выживаемости и роста интернализованных Porphyromonas gingivalis оценивается по количеству колоний на кровяной агаровой пластинке.

Протокол

1. Выживание интернализованных бактерий.

1. Подготовьте анаэробные бактерии P. gingivalis до тех пор, пока они не достигнут среднего логарифмического роста (наружный диаметр₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Центрифугируйте бактерии при давлении 5 000 x g в течение 10 минут.
3. Поместите гранулированный P. gingivalis обратно в камеру и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте PBS и еще раз измельчите гранулированные бактерии перед повторной суспензией в среде VEGF. Приготовьте суспензии для всех штаммов бактерий, подлежащих испытанию, при наружном диаметре₆₆₀ 0,7, что соответствует среднелогарифмической фазе (~7 x 10,⁸ клеток/мл). Теперь бактерии готовы к заражению.
4. Перенесите 6-луночные планшеты, содержащие HUVEC, из инкубатора для тканевых культур в анаэробную камеру. Удалите среду и трижды промойте анаэробным PBS. Добавьте по 2 мл анаэробной среды VEGF в каждую лунку и поместите планшеты при температуре 37 °C в анаэробный инкубатор на 20 минут, чтобы выровнять температуру для инфекции.
5. Заражать клетки-хозяева бактериями при кратности инфекции (бактерии MOI: хозяин) 100:1,
   заметка: Количество клеток HUVEC определяется путем проведения теста на исключение трипана в одной лунке перед инфекцией. Количество бактериальных клеток определяется по оптической плотности (например, OD 0,5 = 5 x 10⁸ клеток/мл). Концентрация бактерий регулируется в соответствии с правильным MOI на основе концентрации HUVEC.
6. Поместите 6-луночные планшеты с инфицированными HUVEC в анаэробный инкубатор и позвольте бактериям взаимодействовать с клетками хозяина в течение 30 минут.
7. Приготовьте сапонин в BHI (1,0% мас./об.) внутри анаэробной камеры и отфильтруйте через фильтр 0,2 мкм.
8. Выньте пластины из инкубатора. Трижды умыться анаэробным PBS и добавить 2 мл среды VEGF с добавленным антибиотиком (300 мкг/мл гентамицина и 400 мкг/мл метронидазола).
9. Инкубируйте в течение 1 часа. Обязательно проверьте антибиотики, чтобы убедиться, что они на 100% эффективны в уничтожении желаемого бактериального штамма и не проникают в клетки хозяина.
10. Аспиратуйте среды, добавьте 2 мл процеженного 1,0% сапонина. Инкубируйте в течение 15 минут, чтобы обеспечить лизис клетки-хозяина.
11. Соскребите дно каждой лунки скребком для ячеек. Соберите клеточную смесь из каждой лунки и сделайте разведение BHI в соотношении 1:1.
12. Приготовьте серийные разведения образца (1:100, 1:1,000).
13. Планшет 200 мкл желаемого разведения на кровяных агаровых пластинах. Оберните пластины в парапленку и поместите их в анаэробный инкубатор.
14. После семи дней инкубации при 37 °C снимите планшеты и подсчитайте КОЕ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Виниловая анаэробная камера-тип B	Лабораторные продукты Coy		Инкубатор модели 2000
TSA II Триптиказ соевый агар с 5% овечьей крови	ББЛ	221261
Пул эндотелиальных клеток пупочной вены человека 10	Технология LifeLine	ФК-0044
Полный комплект VascuLife VEGF Medium	Технология LifeLine	ЛЛ-0003
ТрипКит	жизненно важная коммуникация	ЛЛ-0013
сапонин	Ридель-де Хаэн	16109
Соль сульфата гентамицина	Сигма-Олдрич	Г-1264
Метронидазол	Сигма-Олдрич	М-3761