Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Экспрессия и очистка антител
- Содержание клеток яичников китайского хомяка (СНО)
- Выращивайте клетки CHO в среде FreeStyle CHO с коммерчески доступной добавкой 1x глутамина при 37 °C, встряхивая при 130 об/мин с 5%CO2 с использованием стеклянных или одноразовых колб Эрленмейера delong.
заметка: Настоятельно рекомендуется использовать колбу с перегородкой и вентилируемой крышкой для повышения перемешивания и улучшения газопередачи в условиях встряхивания. Значительно сниженный выход антител был получен при использовании обычных колб (без перегородки) из-за ограниченного перемешивания культуры суспензии.
- Поддерживайте количество клеток в диапазоне 1-5 x 106 клеток/мл с жизнеспособностью клеток >95%. Если количество клеток увеличивается более чем в 5 x 10до 6 клеток/мл, разделите ячейки. Никогда не допускайте, чтобы уровень клеток CHO опускался ниже 0,2 x 106 клеток/мл.
- Трансфекция клеток CHO
- Выращивайте клетки CHO в 200 мл среды (2 x 106 клеток/мл) в колбах с перегородкой Эрленмейера.
заметка: Суспензионные культуры, выращенные в перегородчатых колбах, всегда давали более высокий выход белка по сравнению с выращиванием в неперегородчатых колбах.
- В пробирку объемом 15 мл возьмите 5 мл среды CHO FreeStyle и добавьте 50 г клонированной ДНК VH и 75 г клонированной ДНК VL. Вихрь хорошо перемешать.
- Инкубировать смесь ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин.<бр/>
заметка: Более длительная инкубация снижает выход белка.
- Добавьте 750 мкл 1 мг/мл полиэтиленимина (PEI) в раствор ДНК и агрессивно перебивайте смесь в течение 30 с. Инкубируйте при комнатной температуре еще 5 мин.<бр/>
заметка: ПЭИ должен быть свежим. Многократные циклы замораживания-оттаивания PEI значительно снижают общий урожай.
- Добавьте всю смесь ДНК и ПЭИ к клеткам, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубируйте в перегородке Делонга колбы с ячейками при 37 °С, встряхивая при 130 об/мин.
- Выражение
заметка: Антитело имеет секреторный сигнальный пептид, сконструированный к его N-концевому концу, который помогает антителам выделяться в среду.
- Выращивайте трансфицированные клетки при температуре 37 °C, встряхивая при 130 об/мин в 1-й день.
- На 2-й день добавьте 2 мл 100-кратного антикомкующегося агента и 2 мл 100-кратного антибактериально-антимикотического раствора. Установите колбу на более низкую температуру (32-34 °C), встряхивая со скоростью 130 об/мин.
- Каждый пятый день добавляйте 10 мл корма Tryptone N1 и 2 мл 100-кратной добавки глютамина.
- Продолжайте подсчет клеток каждый третий день с помощью гемоцитометра после окрашивания аликвоты клеток трипановым синим красителем. Следите за тем, чтобы жизнеспособность клеток оставалась выше 80%.
- На 10 или 11 день соберите среду для очистки антител. Открутите культуру при температуре 3000 x g, 4 °C в течение 40-60 минут, а затем отфильтруйте прозрачную среду с помощью бутылочных фильтров 0,22 μM.
- Очистка<бр />
заметка: Очистку антител проводят с помощью коммерчески доступной колонки Protein-A (см. Таблицу материалов) с помощью перистальтического насоса.
- Уравновесьте колонку объемом связывающего буфера в две колонки (20 мМ фосфата натрия при pH 7,4).
- Пропустите отфильтрованную среду, содержащую антитела (полученную на шаге 1.3.5), через колонку со скоростью потока 1 мл/мин.
- Промойте колонку двухколоночным объемом связующего буфера.
- Разбавьте антитело на фракции по 500 мкл, используя элюирующий буфер объемом 5 мл (30 мМ ацетата натрия при pH 3,4).
- Нейтрализуйте рН элюированного антитела путем добавления 10 мкл нейтрализующего буфера (3 М ацетата натрия при рН 9) на фракцию.<бр/>
заметка: Фракция No3-6 содержит большую часть антител. Желательно сохранить все фракции на случай, если антитело будет элюировано в более поздней фракции, чем ожидалось.
- Измерьте концентрацию очищенных антител с помощью спектрофотометра, выбрав протокол по умолчанию для иммуноглобулина G (IgG). Конечную концентрацию антитела получают в мг/мл с учетом молекулярной массы и коэффициента поглощения.
2. Флуоресцентная маркировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела помечены инфракрасным красителем, который содержит реактивную группу эфиров NHS, которая связывается с белками и образует стабильный конъюгат. Эта реакция чувствительна к pH и лучше всего протекает при pH 8,5. Флуоресцентные конъюгаты, меченные красителем, демонстрируют максимум поглощения 774 нм и максимум излучения 789 нм. pH 8,5 является ключом к эффективному конъюгированию.
- Диализ 0,5 мл антитела с помощью диализной кассеты (0,1-0,5 мл) в 1 л конъюгационного буфера (50 мМ фосфатного буфера при pH 8,5). Через 4 часа переложите диализную кассету в свежий буфер и диализируйте на ночь.
- Настройте реакцию конъюгации путем добавления 0,03 мг IRDye 800CW на 1 мг антитела в реакционном объеме 500 μл.<бр/>
заметка: IRDye 800CW растворяют в ДМСО в концентрации 10 мг/мл.
- Проводить реакции мечения в течение 2 ч при 20 °C.
заметка: Увеличение времени свыше 2 часов не улучшает маркировку.
- Очистите меченые конъюгаты с помощью обширного диализа против 1x PBS.
- Оценивайте степень мечения, измеряя абсорбцию красителя при 780 нм и абсорбцию белка при 280 нм. Вклад красителя в сигнал 280 нм составляет 3%.
- Рассчитайте соотношение красителя/белка по следующей формуле:
где 0,03 – поправочный коэффициент на абсорбцию красителя, используемого при длине волны 280 нм (что равно 3,0 % от его абсорбции при длине волны 780 нм), εDye и εProtein – молярные коэффициенты экстинкции для красителя и белка (антитела) соответственно.
Примечание: εКраситель составляет 270 000 М-1 см-1, а εБелок составляет 203 000 М-1 см-1 (для типичного IgG) в смеси PBS и метанола в соотношении 1:1. Белки, отличные от IgG, могут иметь очень разные коэффициенты вымирания моляров. Использование правильного коэффициента экстинкции для интересующего белка имеет важное значение для точного определения соотношения D/P.
- Рассчитайте конечную концентрацию белка по следующей формуле:
заметка: Всегда подтверждайте антигенсвязывающую эффективность меченых и немеченых антител с помощью ИФА (иммуноферментного анализа) или проточной цитометрии, прежде чем приступать к исследованиям in vivo.
3. Исследования ксенотрансплантата мыши
- Подготовка опухолевых клеток к инъекциям
- Выращивайте клетки OVCAR-3 в RPMI-1640 Medium, с добавлением 10% FBS и 1x пенициллин-стрептомицина.
- За день до введения субкультуральные клетки помещают в новые 100 мм чашки для культур с 10 мл готовой среды/чашки. Используйте номер ячейки 0,5-1 x 106 ячеек/чашка.
- Инкубировать культуры при температуре 37 °C, влажности 95% и 5%CO2 в течение 20-24 часов.
- В день инъекции удалите питательную среду из посуды для культуры. Тщательно промойте клеточный слой свободным фосфатно-солевым раствором Дульбекко (DPBS) Ca2+/Mg2+, чтобы удалить мертвые клетки, клеточный мусор и все следы сыворотки, которые могут препятствовать действию трипсина.
- Трипсинизируйте клетки, добавив 1,0-1,5 мл раствора Trypsin-EDTA в каждую чашку, и попытайтесь распределить раствор, наклонив чашку по всему периметру, с последующей инкубацией при 37 °C в течение 5-10 мин.<бр/>
заметка: Наблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом, чтобы проверить фактический статус трипсинизации. При трипсинизации меньшее количество клеток отделяется от поверхности чашки для культивирования, при более высокой трипсинизации индуцируется клеточный стресс. Таким образом, правильная трипсинизация важна.
- Добавьте 1,0-1,5 мл полной питательной среды в каждую чашку, чтобы остановить действие трипсина, после чего повторно присунзируйте клетки путем аккуратного пипетирования.
заметка: Щадящее пипетирование важно для поддержания здоровья клеток.
- Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и вращайте при температуре 250 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Соберите клеточную гранулу после удаления надосадочной жидкости и промойте ячейки, повторно суспензив гранулу в 1x DPBS.
- Вращайте клеточную суспензию на низкой скорости 250 x g в течение 5 минут.
- Добавьте 500 мкл DPBS и повторно суспендируйте клетки с помощью щадящего пипетирования, чтобы получить суспензию одиночных клеток.
- Подсчет клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
заметка: Для лучшей точности повторите подсчет три раза и возьмите среднее значение.
- Отрегулируйте объем таким образом, чтобы итоговая плотность ячеек составила 1 х 108 ячеек/мл.
- Подкожное введение клеток для развития ксенотрансплантатов мыши
заметка: Все процедуры должны выполняться в защитном шкафу BSL2. В текущем исследовании использовались мыши Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+.
- Возьмите 50 мкл клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл и смешайте с 50 мкл среды матрикса базальной мембраны.
заметка: Базальная мембрана матричной среды имеет тенденцию к образованию гелеобразного состояния при комнатной температуре, поэтому тщательно выдерживайте клетки и матричную среду на льду. Рекомендуется хранить трубки, наконечники и шприцы в холодильнике, а затем перекладывать их на лед перед инъекцией животного.
- Перемешивайте смесь, чтобы избежать слипания клеток. Затем возьмите эти 100 мкл смеси клеточной суспензии и матричной среды, содержащей 5 x 106 клеток, в шприц объемом 1 куб. см.
- Осторожно приподнимите кожу животного, чтобы отделить кожу от нижележащего мышечного слоя, и медленно введите клеточную суспензию (100 мкл) под кожу (5 x 106 клеток) с помощью иглы 26 G. Подождите несколько секунд, прежде чем вынимать иглу, чтобы среда базальной матрицы могла сформировать полутвердую гелеобразную структуру вместе с клетками под кожей, предотвращая выход смеси из места инъекции.
заметка: Перед инъекцией клетки должны быть проверены на наличие любых загрязнений, которые могут нанести вред иммунодефицитным мышам. Во время инъекции не вводите иглу слишком глубоко в кожу, так как это может привести к образованию опухоли глубже, чем ожидалось.
- Держите животное в стерильной клетке и наблюдайте около 20 минут.
- Понаблюдайте за мышами в течение 2-3 недель и дайте опухоли вырасти до 500 мм3 в размере.
4. Локализация антител с помощью системы визуализации in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование для визуализации in vivo (см. Таблицу материалов), используемое в этом эксперименте, использует набор высокоэффективных фильтров и спектральных алгоритмов расмешивания для неинвазивной визуализации и отслеживания клеточной и генетической активности в живом организме в реальном времени. Система обеспечивает возможность мониторинга как флуоресценции, так и биолюминесценции.
- Введите 25 мкг меченного красителем антитела через хвостовую вену.
- Обезболите мышей-опухоленосителей с помощью 2% изофлурана. Проверьте на отсутствие реакции на педальные рефлексы.
- Как только мыши перестанут двигаться, расширьте боковую хвостовую вену, применив воду от червей.
- Введите 25 г (в 100 мкл) меченого антитела с помощью инсулинового шприца объемом 1 куб. см с иглой 26 G.
- Аналогичным образом, в качестве отрицательного контроля пометьте и введите неспецифическое антитело изотипа IgG1, которое не нацелено на раковые клетки.
- Выполняйте визуализацию in vivo в реальном времени через 8, 24, 48 ч и т.д. после инъекций антител.
- В соответствующем программном обеспечении нажмите кнопку Initialize (Инициализация) на панели управления и подтвердите, что температура ступени составляет 37 °C.
- Включите подачу кислорода, все насосы на анестезиологической системе и подачу газа изофлурана в анестезиологическую камеру и установите клапан испарителя изофлурана на 2%.
- Перенесите мышей в анестезиологическую камеру и подождите, пока мыши полностью обезболится. Наносите на глаза смазывающую мазь, чтобы избежать пересыхания глаз.
- Перейдите в Панель управления, настройте флуоресцентную визуализацию через опцию Мастер визуализации и выберите возбуждение на 773 нм и излучение на 792 нм.<бр/>
заметка: Настройки автоматической экспозиции по умолчанию обеспечивают хорошее флуоресцентное изображение. Тем не менее, настройки автоматической экспозиции могут быть изменены в соответствии с потребностями.
- Перенесите мышей под наркозом в камеру визуализации и соберите их на поле визуализации с помощью носового конуса. Сцена визуализации позволяет разместить 5 мышей одновременно.
заметка: Сделайте снимки контрольных мышей вместе с тестовыми мышами, чтобы получить одинаковое количество экспозиции и другие настройки во время анализа.
- Когда все будет готово, выберите опцию «Получить» на панели управления для получения изображения.
- С настройками автоэкспозиции система генерирует изображение в течение минуты. Сгенерированное изображение представляет собой наложение флуоресценции на фотографическое изображение с интенсивностью оптической флуоресценции, отображаемой в единицах счета или фотонах или выражениях эффективности.
- После получения изображения перенесите мышей из камеры визуализации обратно в клетку и наблюдайте за их восстановлением в течение 1–2 минут.
- Выполните дальнейшую тонкую настройку изображения с помощью инструментов и функций, предоставляемых в программном обеспечении для анализа изображений. Инструменты анализа изображений находятся в строке меню и палитре инструментов.
- В разделе «Настройка изображения» отрегулируйте яркость, контрастность или непрозрачность, а затем выберите цветовую шкалу.
- Используйте инструменты ROI для указания области интереса (ROI) на оптическом изображении и измерения интенсивности сигнала в пределах ROI. При необходимости экспортируйте количественные данные сигнала в программное обеспечение для работы с электронными таблицами и постройте данные.
- Для последующих исследований проанализируйте вскрытие мышами различных тканей (например, печени, легких, сердца, почек, селезенки, мозга и т. д.) бок о бок для детального неспецифического распределения флуоресцентно меченных антител.
заметка: Данные могут быть дополнительно подкреплены тканеспецифическим ИФА путем использования антигена (в данном случае FOLR1) в 96 анализах.