$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Окрашивание проточной цитометрией инфицированных Mtb моноцитарных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены на объекте BSL-3. Окрашивание проточной цитометрией может быть выполнено в 96-луночном планшете, а не в пробирках.
- Отделите Mycobacterium tuberculosis, Mtb-инфицированные клетки (и неинфицированные контрольные клетки) от лунок в 6-луночном планшете (планшетах) путем инкубации с 1 мл буфера FACS на лунку в течение не менее 30 минут при 37 °C и 5%CO2.
Осторожно проводите - пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что ячейки отсоединены. По возможности подтвердите отслойку клеток с помощью микроскопии. Перенесите клеточную суспензию из каждой лунки в микроцентрифужную пробирку с винтовой крышкой и вращайте пробирки при давлении 200 x g в течение 5 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетирования.
- Промойте гранулу ячейки в каждой пробирке дважды с помощью буфера FACS и вращайте ячейки при 200 x g в течение 5 минут.
- Окрашивайте клетки (примерно от 0,5 x 106 до 1 x 106 клеток/пробирку) коктейлем примерно 50 мкл конъюгированных флуорохромом античеловеческих антител, включая TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Таблица 1) в сочетании с жизнеспособным красителем Zombie-UV в течение 30 минут при 4 °C (холодильник) в темноте.
- Дважды промойте окрашенные клетки 400 μл буфера FACS и вращайте клетки при 200 x g в течение 5 минут.
- Зафиксировать окрашенные клетки 200 мкл фиксирующего буфера (свежеприготовленного) на 30 минут при РТ в темноте, чтобы обеспечить полную инактивацию микобактерий.
- Дважды промойте ячейки 400 μл буфера FACS и вращайте при 200 x g в течение 5 минут, чтобы удалить излишки фиксирующего буфера.
- Ресуспендируйте фиксированные клетки в буфере FACS объемом 400 мкл и перенесите образцы в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл перед тем, как извлечь их из лаборатории BSL-3 для проточной цитометрии в BSL-2. Храните окрашенные клетки при температуре +4 °C до получения образца.
заметка: Распылите на пробирки 70% этанола перед тем, как вынести их из лаборатории BSL-3. Формальдегид токсичен (канцерогенен) и должен обрабатываться в шкафу класса биобезопасности II. Отходы формальдегида следует выбрасывать в отдельный химический отход.
2. Сбор проточных цитометрических данных и анализ клеток, полученных из моноцитов, инфицированных Mtb
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1–2.2 должны быть выполнены до окрашивания проточной цитометрией, описанным выше. Чтобы избежать проблем с комкованием клеток и диссоциацией тандемных красителей после фиксации клеток, сбор образцов как Mtb-инфицированных, так и неинфицированных клеток проводят в течение 4-10 ч после первичного окрашивания антителами.
- Перед описанным выше окрашиванием методом проточной цитометрии необходимо компенсировать флуоресцентный сигнал для каждого флюорохром-конъюгированного антитела, перечисленного на окрашивающей панели (табл. 1), с помощью компенсационных шариков (как положительных, так и отрицательных).
- Титруйте разведение антител для окрашивания макрофагов человека для получения оптимального сигнала для каждого флуорохрома.
- Используйте неокрашенные клетки для определения уровня фоновой флуоресценции, необходимого для установки ворот для популяции отрицательных клеток, позволяющих визуализировать окрашенные клетки (макрофаги обладают высокой аутофлуоресцентностью).
- Получите минимум 50 000 клеток/образец с помощью проточного цитометра с использованием рекомендованного программного обеспечения для сбора данных.
- Экспортируйте файлы сбора данных с проточного цитометра в формат стандарта проточной цитометрии (FCS) 3.1.
- Анализируйте файлы FCS в программном обеспечении для анализа проточной цитометрии.
- Заграждайте макрофаги в соответствии с их характеристиками прямого и бокового рассеяния (FSC и SSC) и исключите мертвые клетки путем гейтирования живых/мертвых клеток с использованием красителя жизнеспособности Zombie-UV.
- Визуализируйте инфицированные H37Rv-GFP макрофаги в канале FITC.
- Определите частоту положительно окрашенных клеток и геометрическую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) для всех маркеров (Таблица 1).
Таблица 1: Список антител, используемых для проточной цитометрии.
)
См.
| лазер | фильтр | Флуорохром | фенотип | функция | клон | Каталожный No | компания |
| Номер 639 | 670/30 | АФ647 | ТЛР2 | Рецептор распознавания патогена | ТЛ2.1 | 309714 | Биолегенда |
| Номер 639 | 780/60 | БТР-CY7 | КД206 | Маннозный рецептор | 15-2 | 321120 (Английский | Биолегенда |
| 405 | 610/20 | БВ605 | КД163 | Рецептор падальщика | ГИ/61 | 333616 | Биолегенда |
| 405 | 670/30 | БВ650 | КД80 | Костимулирующая молекула | 2Д10 | 305227 | Биолегенда |
| 405 | 710/50 | БВ711 | ККР7 | Хемокиновый рецептор | Г043Н7 | 353228 | Биолегенда |
| 405 | 780/60 | БВ785 | КД86 | Костимулирующая молекула | ИТ2.2 | 305442 | Биолегенда |
| 488 | 530/30 | GFP | Горный велосипед | Внутриклеточные бактерии | | | |
| 561 | 586/15 | ПЭ | КД200Р | Тормозной рецептор | ОКС-108 | 329306 | Биолегенда |
| 561 | 620/14 | ПЭ/ОСЛЕПИТЕЛЬНЫЙ 594 | КД64 | Fc гамма-рецептор-I IgG | 10.1 | 305032 | Биолегенда |
| 561 | 661/20 | PE-Cy5 (ПК5) | HLA-DR | Молекула MHC класса II | Л243 | 307608 | Биолегенда |
| 355 | 450/50 | БУВ395 | Жизнеспособность красителя | Маркер живых/мертвых клеток | Зомби УФ | 423108 | Инвитроген |