Анализ in vitro для изучения цитотоксической способности цитокин-индуцированных клеток-киллеров

Аннотация

Источник: Hsiao, C. H., et al. Выделение и экспансия цитотоксических цитокин-индуцированных киллерных Т-клеток для лечения рака. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует метод in vitro для измерения цитотоксической способности цитокин-индуцированных киллеров (CIK) против раковых клеток. После совместного культивирования раковых клеток-мишеней с клетками CIK мертвые раковые клетки идентифицируют с помощью флуоресцентного красителя жизнеспособности и количественно оценивают с помощью проточной цитометрии, оценивая цитотоксический эффект клеток CIK.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка материалов

1. Храните реагенты, антитела и химические вещества в соответствии с Паспортом безопасности материалов (MSDS). Растворите лекарственные препараты или цитокины в растворителях в виде исходных растворов, а затем добавьте аликвоту для хранения при температуре -20 °C или -80 °C.
   заметка: Подробная информация по подготовке материала указана в Таблице материалов.

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)

1. Перед применением раствор градиента плотности (Таблица материалов) нагрейте до 18–20 °C. Переверните флакон с раствором несколько раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
2. Соберите 3−5 мл образца венозной крови человека в гепаринизированный флакон и хорошо перемешайте, осторожно перевернув пробирку несколько раз.
3. Приготовьте 4 мл раствора градиента плотности в стерильной пробирке объемом 15 мл.
Осторожно нанесите
4. 1 мл образца крови на раствор градиента плотности.
5. Центрифугировать при 400 х г в течение 30 мин при 18−20 °C (выключить перерыв).
6. Осторожно и немедленно аспирируйте охристый слой мононуклеарных клеток (около 1 мл), чтобы не нарушить слои, до стерильной пробирки объемом 15 мл с помощью стерильной пипетки объемом 1 мл.
7. Добавьте не менее 3 объемов (~3 мл) фосфатно-солевого буфера (PBS) в охристую оболочку в центрифужной пробирке. Подвешивайте клетки, аккуратно пипетируя их вверх и вниз не менее 3 раз с помощью стерильной пипетки.
8. Центрифугировать при 400 х г в течение 10 мин при 18−20 °С. Отсадить надосадочную жидкость.
9. Суспензируйте клеточную гранулу с 5 мл базальной среды (Таблица материалов) и переложите в колбу. Культивируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур при 37 °C и 5%_CO2.

3. Индукция и расширение CIK

1. В день 0 культивируют PBMC (1 x 10⁶) в свежей базальной среде, содержащей 1000 МЕ/мл ИФН-γ, в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе для клеточных культур при 37 °C и 5%_CO2.
2. В 1-й день обновите среду свежей базальной средой, содержащей 50 нг/мл анти-CD3 антител, 1 нг/мл рекомбинантного человеческого (rh) IL-1α и 1000 Ед/мл rh IL-2. Обновляйте средство каждые 3 дня.
3. На 7-й день обновите среду свежей базальной средой, содержащей 1000 Ед/мл резус-фактора IL-2. Обновляйте среду каждые 3 дня до окончания клеточного роста (14 день).

4. Иммунофенотипирование для оценки клеток CIK

1. Промойте клетки ЦИК 10 мл стерильного PBS. Центрифугировать в течение 10 мин при 300 x g и 18−20 °C, отсасывать надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки 10 мл PBS. Подсчитайте количество клеток и проверьте жизнеспособность клеток с помощью теста исключения трипанового синего.
2. Аликвотируйте клетки CIK в шесть стерильных пробирок объемом 1,5 мл с плотностью ~5–10 x 10⁵ клеток/мл PBS. Промаркируйте и обработайте следующим образом: Пробирка 1, Бланк (без антител); Пробирка 2, добавить 20 мкл изотипа IgG1-FITC; Пробирка 3, добавить 20 мкл изотипа IgG1-APC mAb; Пробирка 4, добавить 20 мкл CD3-FITC; Пробирка 5, добавьте 20 мкл CD56-APC mAb; и пробирку 6, добавьте 20 μл CD3-FITC и 20 μл CD56-APC mAb.
3. Осторожно перемешайте клетки CIK с антителами, осторожно дозируя их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл, а затем инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Центрифугируйте пробирки в течение 10 мин при 300 x g и 18−20 °C. Отсадите надосадочную жидкость и однократно суспензируйте клеточную таблетку 1 мл PBS. Аккуратно переведите их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл.
5. Повторите шаг 4.4.
6. Оставьте пробирки в темноте перед проточным цитометрическим анализом.

5. Распознавание маркеров CD

1. Перенесите клеточную суспензию в стерильную полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл с крышкой-фильтром (ячейки 100 мкм), аккуратно проведя пипетированием через колпачок. Выложите трубочки на карусель по порядку.
2. Откройте программу для анализа проточной цитометрии и создайте папку для экспериментов. Нажмите кнопку «Новый образец», чтобы добавить образец и пробирку в эксперимент, и назовите пробирки следующим образом: Пробирка 1, Пусто; пробирка 2, изотип IgG1-CD3; пробирка 3, изотип IgG1-CD56; Трубка 4, CD3; Трубка 5, CD56; Трубка 6, CD3CD56.
3. Создание системы фильтрации рассеяния для популяций клеток CIK (рис. 1A).
   1. Выберите Tube 1 (Blank) и нажмите кнопку Dot Plot, чтобы создать график FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольный затвор над всей популяцией клеток с порогом FSC-A >5 x 10⁴, чтобы исключить клеточный мусор.
   2. Выберите параметр SSC-A/SSC-H для новой точечной диаграммы и нарисуйте многоугольный вентиль вокруг всех отдельных ячеек. Выберите параметры Count/FITC (CD3) и Count/APC (CD56) для нового графика гистограммы соответственно. Выберите параметр FITC (CD3)/APC (CD56) для новой точечной диаграммы и нарисуйте четырехквадрантный вентиль для определения четырех субпопуляций.
   3. Запишите данные из 20 000 отдельных клеток в каждом образце. Нажмите кнопку Загрузить образец, чтобы сначала проанализировать образец элемента управления Blank. Идентификация всей популяции клеток CIK с помощью параметров каналов CD56 и CD3.
4. Повторите шаг 5.3 для исследования всех образцов.
5. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, чтобы проанализировать популяции клеток CIK и повторно распечатать их в файлах анализа.

6. Культивирование и окрашивание клеток хронического миелоидного лейкоза человека K562 и клеток OC-3 рака яичников

1. Элементы K562
   1. Культивировать клетки K562 в полноценных средах (базальная среда RPMI, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS] и 50 ЕД/мл антибиотиков, и регулировать уровень глюкозы до 4,5 г/л) при плотности 0,5−1 x 106 клеток/мл в колбе для клеточных культур и инкубировать в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
   2. Переложите питательную среду, содержащую клетки K562, в стерильные пробирки объемом 50 мл и гранулируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при 18−20 °C в день эксперимента.
   3. Аспирируйте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 5 мл стерильного PBS и хорошо перемешайте.
   4. Гранулируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в PBS и доведите клетки K562 до концентрации 0,5-1 x 10⁶ клеток/мл.
   5. Добавьте 0,5 мкл красителя карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE) к 1 мл клеточной суспензии K562 в стерильной пробирке объемом 15 мл при конечной концентрации 5 мкМ. Осторожно перемешайте суспензию пипетированием вверх и вниз не менее 3 раз.
   6. Оставьте пробирку в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 10–15 минут.
   7. Добавьте 9 мл PBS в пробирку и гранулируйте клетки в концентрации 300 x g в течение 10 мин. Сцедите надосадочную жидкость, а затем суспензируйте клеточную гранулу в 10 мл готовой среды. Переложите клеточную суспензию в колбу для клеточных культур и поместите в инкубатор.
2. Элементы OC-3
   1. Культивирование клеток OC-3 в готовых средах (среда DMEM/F12, содержащая 10% FBS и 50 ЕД/мл антибиотиков) с плотностью 0,5–1 x 10⁶ клеток в колбе для клеточных культур при 37 °C и 5%_CO2.
   2. Отсадите питательную среду и промойте клетки PBS за 1 день до эксперимента.
   3. Отделите клетки, добавив 1 мл раствора фермента диссоциации клеток (Таблица материалов) и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C.
   4. Приостановите ячейки, добавив 5 мл PBS, и хорошо перемешайте. Гранулируйте клетки при 300 х г в течение 10 минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в PBS и отрегулируйте их до концентрации 0,5–1 x 10⁶ клеток/мл.
   5. Добавьте 0,5 мкл красителя CFSE в 1 мл клеточной суспензии OC-3 в стерильную пробирку объемом 15 мл в конечной концентрации 5 мкМ. Осторожно перемешайте суспензию, пипетируя вверх и вниз не менее 3 раз.
   6. Оставьте пробирку в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 10–15 минут.
   7. Добавьте 9 мл PBS в пробирку и гранулируйте клетки в концентрации 300 x g в течение 10 мин. Сцедите надосадочную жидкость, а затем суспензируйте клеточную гранулу с готовой средой. Высадите 5 x 10⁵ клеток/лунку в 6-луночный планшет и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи.

7. Цитотоксический анализ

1. Кокультура клеток CIK и K562 (CIK-K562)
   1. Подсчитайте клетки K562 на шаге 6.1.7 и проверьте жизнеспособность клеток с помощью анализа исключения трипанового синего. Добавьте 1 мл клеток K562 в каждую лунку в 6-луночном планшете с плотностью 5 x 10⁵/мл.
   2. Добавьте 1 мл базальной среды с клетками CIK или без них из шага 3.4 в 6-луночный планшет из шага 7.1.1 следующим образом: Лунка 1 = Бланк, только клетки K562 (5 x 10⁵); Скважина 2 = только окрашенные CFSE клетки K562 (5 x 10⁵); Лунка 3 = клетки CIK (E [эффектор], 25 x 10⁵) + окрашенные CFSE клетки K562 (T [мишень], 5 x 10⁵); Лунка 4 = клетки CIK (E, 50 x 10⁵) + окрашенные CFSE клетки K562 (T, 5 x 10⁵).
   3. Смешайте клеточные суспензии, осторожно дозируя их вверх и вниз не менее 3 раз. Поместите пластину в инкубатор на 24 часа.
2. Кокультура клеток CIK и OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Добавьте 1 мл базальной среды с клетками CIK или без них из шага 3.4 в 6-луночный планшет из шага 6.2.7 следующим образом: Лунка 1 = пустая, только клетки OC-3 (5 x 105); Скважина 2 = только окрашенные CFSE клетки OC-3 (5 x 10⁵); Лунка 3 = клетки CIK (E, 25 x 10⁵) + окрашенные CFSE клетки OC-3 (T, 5 x 10⁵); Лунка 4 = клетки CIK (E, 50 x 10⁵) + окрашенные CFSE клетки OC-3 (T, 5 x 10⁵).
   2. Смешайте клеточные суспензии, аккуратно пипетируя их вверх и вниз не менее 3 раз. Поместите тарелку в инкубатор на 24 часа.
3. 7-Аминоактиномицин D (7-AAD) окрашивание красителем
   1. Соберите клеточную суспензию CIK-K562 с шага 7.1.3 непосредственно в стерильную пробирку объемом 15 мл.
   2. Соберите как суспензионные, так и адгезивные клетки из групп CIK-OC-3 на шаге 7.2.2.
      1. Перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 15 мл. Промойте лунку 1 мл стерильного PBS, соберите PBS и добавьте в пробирку. Добавьте 0,5 мл раствора фермента диссоциации клеток и инкубируйте в течение 5 минут при температуре 37 °C.
      2. Добавьте 1 мл раствора из той же пробирки в соответствующую лунку и аккуратно перемешайте клетки, пипетируя их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл. Соберите все клетки в одну пробирку.
   3. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл стерильного PBS. Гранулируйте клетки в дозе 300 x g в течение 10 минут, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 мкл стерильного PBS.
   4. Добавьте 5 мкл красителя 7-AAD (50 нг/мкл запаса) в клеточную суспензию. Аккуратно перемешайте клетки, пипетируя их вверх и вниз не менее 3 раз стерильной пипеткой объемом 1 мл. Выдержать в течение 10 минут и оставить в темноте перед анализом.
4. Анализ цитолитической способности
   1. Смешайте клеточную суспензию из шага 7.3.4 и повторите шаги 5.1 и 5.2 один раз.
   2. Нажмите кнопку «Новый образец», чтобы добавить образец и пробирку в эксперимент, и назовите пробирки следующим образом: Пробирка 1, только клетки K562 (или OC-3); Трубка 2, только элементы K562 (или OC-3), окрашенные CFSE; Трубка 3, E:T = 5:1; Трубка 4, E:T = 10:1.
   3. Создание системы Scatter Gating System для цитолитического анализа (Рисунок 2A).
      1. Выберите трубку 1 и нажмите кнопку «Точечная диаграмма», чтобы создать график FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольный затвор над всеми событиями с пороговым значением FSC-A >5 x 10⁴, чтобы исключить клеточный мусор.
      2. Выберите параметр SSC-A/CFSE для новой точечной диаграммы. Выберите параметр 7-AAD/CFSE для новой точечной диаграммы и нарисуйте четырехквадрантный вентиль для определения четырех субпопуляций.
      3. Нажмите кнопку Загрузить образец, чтобы сначала проанализировать пустой контрольный образец.
      4. Отрегулируйте напряжение SSC-A и FSC-A. Идентификация популяции мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7-AAD. Запишите данные от > 20 000 клеток CFSE+ в каждом образце.
   4. Повторите действия в разделе 7.4.6 для исследования всех образцов.
   5. Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, чтобы проанализировать популяции нежизнеспособных клеток и экспортировать данные в файлы анализа.

Результаты

Рисунок 1: Доля CD3⁺CD56⁺ Т-клеток из репрезентативной выборки PBMC. (А) Лимфоциты распознавались по определенному размеру и зернистости. Выбрана популяция одиночных клеток для анализа методом проточной цитометрии. (B) Статистический анализ эффективности расширения CIK от трех здоровых доноров был проведен с использованием t-критерия (*, p < 0,01).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
7-аминоактиномицин D	БД	559925
Антитела APC Mouse Anti-Human CD56	БД	555518	В159
APC Мышь IgG1, контроль изотипа	БД	555751	МОПЦ-21
Проточный цитометр BD FACSCanto II	БД	338962		СН: R33896202856
Карбоксифлуоресцеин диацетата сукцинимидиловый эфир (CFSE)	БД	565082		Реконструирование красителя CFSE (500 мг) с 90 мл ДМСО
D-(+)-раствор глюкозы	сигма	Г8644		Для культуры клеток K562. Добавьте от 12,5 мл до 500 мл готовой среды
Модифицированный Eagle Medium/F12 от Dulbecco	ГиКлон	SH30023.02		Базальная среда для культивирования клеток OC-3
Фетальная бычья сыворотка	ГиКлон	SH30084.03		Для клеточных культур K562 и OC-3. Готовая среда содержит 10% FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	71101700-ЭК		Решение для градиента плотности
FITC Мышиное антитело к человеческому CD3	БД	555332	UCHT1
FITC Мышь IgG1, контроль изотипа	БД	555748	МОПЦ-21
Анти-CD3 mAb человека	Такара	Т210	ОКТ3	Добавьте 2,5 мл бустера (1 мг/1 мл) в 50 мл индукционной среды. Запас при -80 °C
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122		Добавьте 5 мл исходного материала (10 000 Ед/мл) к 500 мл готовой среды. Хранить запас при температуре 4 °C.
Пролейкин	НОВАРТИС			Восстановите порошок пролейкина (22x106 МЕ) с 1,2 мл стерильной воды и добавьте 2,7 мл к 50 мл индукционной среды. Запас при -20 °C
Рекомбинантный человеческий интерферон-гамма	СеллГеникс	1425-050		Восстановите rh ИФН-г (5x105 МЕ/50 мкг) с 200 мкл стерильной воды и добавьте от 20 мл до 50 мл индукционной среды. Запас при -20 °C
Рекомбинантный человеческий интерлейкин-1 альфа	ПЕПРОТЕХ	200-01А		Восстановите rh IL-1α (10 μг) с 1 мл стерильной воды и добавьте от 5 мл до 50 мл индукционной среды. Запас при -20 °C
RPMI1640 средний	Gibco	11875-085 (Английский)		Базальная среда для клеточной культуры K562. Запас при 4 °C
Центрифуга Sigma 3-18K	сигма	10295
Фермент TrypLE Express	Gibco	12605028		Фермент диссоциации клеток; Для отсоединения адгезивных клеток. Хранение при комнатной температуре
X-VIVO 15 средний	Лонза	04-418Q		Базальная среда для клеток PBMC и CIK. Хранение при температуре 4 °C