Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте стоковый раствор питательной среды для сбора цельных тканей: 1 л модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 110 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 11 мл пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 1%) и 1,1 мл стерилизованного фильтром инсулина (конечная концентрация 0,1%). Храните исходный раствор при температуре 4 °C.
- Приготовьте хелатирующий буфер #1: 30 мл питательных сред (как описано в. 1.1), 600 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (конечная концентрация 10 мМ), 300 мкл гентамицина (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицина В (конечная концентрация 0,2%). Храните исходный раствор при температуре 4 °C.
- Приготовьте хелатирующий буфер #2: 30 мл питательных сред (как описано в. 1.1), 300 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация 5 мМ), 300 мкл гентамицина (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицина В (конечная концентрация 0,2%). Храните исходный раствор при температуре 4 °C.
- Приготовьте питательную среду для человека: 41,4 мл DMEM/F-12, 5 мл FBS (конечная концентрация 10%), 500 μл пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 1%), 500 μл L-глутамина (конечная концентрация 1%), 500 μл гентамицина (конечная концентрация 1%), 100 μл амфотерицина B (конечная концентрация 0,2%), 500 μл 1 М N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этановой сульфоновой кислоты (HEPES) (конечная концентрация 10 мМ), 500 мкл 100x N-2 добавки и 1 мл 50x B-27 добавки минус витамин А общим объемом 50 мл. Хранить исходный раствор при температуре -20 °С.
- Приготовьте питательную среду для человека Minigut Complete: 10 мл среды Minigut для человека (приготовленную в 1,4), 10 мкл 100 г/мл Wnt3a (конечная концентрация 100 нг/мл), 10 мкл 100 г/мл ноггина (конечная концентрация 100 нг/мл), 10 мкл 1 мг/мл R-спондина (конечная концентрация 1 г/мл), 10 мкл 500 мкг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (конечная концентрация 50 нг/мл), 10 мкл 1 М N-ацетилцистеина (конечная концентрация 1 мМ), 10 мкл 10 мкм Y-27632 (конечная концентрация 10 мкМ), 10 мкл 500 мкМ А-83 (конечная концентрация 500 нМ), 10 мкл 10 мМ SB202190 (конечная концентрация 10 мкМ), 100 мкл 1 М никотинамида (конечная концентрация 10 мМ) и 1 мкл 100 мкМ [лей] 15-гастрина 1 (конечная концентрация 10 нМ). Общий объем 10 мл. Храните исходный раствор при температуре 4 °C.<бр/>
заметка: Растворы должны быть использованы в течение 48 часов.
2. Выделение и покрытие крипты из цельной ткани
- Во время сбора в операционном блоке поместите образец ткани тонкой кишки человека в холодный фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS). Промойте образец в холодном DPBS до тех пор, пока не исчезнут стул и кровь. Хранить образец при температуре 4 °C в среде RPMI 1640 до готовности к изоляции крипты.
заметка: Ткань не может храниться более 24 часов.
- Убедитесь, что образец свободен от стула и крови. С помощью деликатных ножниц для препарирования удалите лишний жир или хирургические зажимы/скобы и т. Д. Взвесьте образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к кусочку примерно 0,75-2,5 г.
- Разрежьте образец на кусочки по 0,5 см и поместите в него 30 мл хелатирующего буфера #1 (как приготовлено на шаге 1.2).
- Встряхивайте на низкой скорости в течение 15 минут при температуре 4 °C.
- Отфильтруйте ткань через клеточное сетчатое фильтр 100 мкм и отбросьте поток.
- Добавьте салфетку в 30 мл хелатирующего буфера #2 (как приготовлено на шаге 1.3).
- Встряхивайте на низкой скорости в течение 15 минут при температуре 4 °C.
- Отфильтруйте ткань через клеточное сетчатое фильтр 100 μм и отбросьте поток.
- Разморозьте 500 мл матрицы базальной мембраны на льду для использования на шаге 2.8.
- Добавьте салфетку к 10 мл холодной DMEM в коническую пробирку объемом 50 мл и энергично встряхивайте рукой в течение 10 секунд.
- Профильтруйте через сетчатый фильтр 100 мкм и проведите через него (Этикетка #1). Держите тюбик #1 на льду.
- Добавьте салфетку еще в 10 мл холодной DMEM в отдельную коническую пробирку объемом 50 мл и энергично встряхивайте рукой в течение 10 секунд.
- Профильтруйте через сетчатый фильтр 100 μм и соберите поток (этикетка #2).
- Повторите еще два раза, пока не получится четыре конические трубки с проточным потоком (пробирки с маркировкой #1-4).
- Отфильтруйте раствор из трубки #1 через сетчатый фильтр 100 мкм и передайте поток в коническую трубку объемом 15 мл (Этикетка #1). Повторите для #2-4.
- Центрифугируйте пробирки на 15 мл #1-4 при 200 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- В ламинарном проточном колпаке извлеките надосадочную жидкость из трубок #1-4 и выбросьте. Избегайте разрушения облака ткани непосредственно над гранулой, даже если для этого придется оставить некоторое количество надосадочной жидкости.
- Медленно пипетируя, смешайте гранулу с остатками надосадочной жидкости в пробирках #1-4.
- Переложите смесь из пробирок #1-4 в одну коническую пробирку объемом 2 мл.
- Центрифугируйте коническую пробирку при температуре 200 x g в течение 20 минут при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 μл матрицы базальной мембраны.
заметка: Всегда держите матрицу базальной мембраны на льду и быстро приступайте к следующим шагам. Этот продукт очень быстро полимеризуется при комнатной температуре.
- Нанесите 50 мкл суспензии образца/базальной мембраны на центр лунки в 24-луночном планшете. Он должен иметь куполообразную форму.
заметка: Использование охлажденных наконечников для пипеток способствует более плавному переносу суспензии, сводя к минимуму полимеризацию.
- Повторите 9 раз, чтобы заполнить всего 10 лунок.
- Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с 5% CO2 при температуре 37 °C на 30 минут, чтобы обеспечить полимеризацию.
- Добавьте 500 μL Human Minigut Media Complete (как приготовлено на шаге 1.5) в каждую лунку. Заменяйте каждые 2 дня.
- Собирают энтероиды через 5-10 дней, когда визуализируется бутонизация. Инструкции по сбору см. в шагах 4 и 5.
3. Индукция экспериментального NEC
- Добавьте 10 мкл 5 мг/мл липополисахарида (ЛПС) в 500 мкл Human Minigut Media Complete (как приготовлено на шаге 1.5) в каждую лунку в день 0. Заменять каждые 2 дня до сбора.
