Анализ адгезии in vitro для выявления адгезии раковых клеток к нейтрофильным внеклеточным ловушкам

Аннотация

Najmeh, S., et al. Упрощенное выделение и обращение с внеклеточными ловушками нейтрофилов человека (НВЛ). J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем анализ с использованием флуоресцентной микроскопии для обнаружения адгезии раковых клеток к нейтрофильным внеклеточным ловушкам (НВЛ). В тестовых лунках наблюдается заметное увеличение числа флуоресцентно меченых раковых клеток, адгезирующих к НВЛ, в то время как лунки, обработанные ДНКазой, демонстрируют сниженную адгезию раковых клеток к НВЛ.

Протокол

1. Анализ статической адгезии раковых клеток НЭО

1. Добавьте 100 мкл ранее полученного запаса NET на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном и дайте покрыть лунки O/N при 4 °C в темноте.
2. Через 12–20 часов проверьте образование однородного монослоя бесклеточных НВЛ на дне лунок под микроскопом (рис. 1). На этом этапе аккуратно отсасывайте весь неадгезивный материал из лунок, следя за тем, чтобы не нарушить монослой NET на дне.
3. Добавьте 100 μл 1% блокирующего раствора бычьей сыворотки альбумина (BSA) в каждую лунку и оставьте на 1 час в режиме RT.
4. Отделите раковые клетки A549 от колбы T-75, используя 2 мл 0,25% раствора трипсина. После отделения добавьте 10 мл среды A549 в трипсинизированные клетки и центрифугируйте при 450 x g при 4 °C в течение 5 минут. Отбросить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в средах до получения концентрации 2 х10⁴ раковых клеток на 100 мкл среды.
   заметка: Клетки А549 выращивали отдельно. Вкратце, клетки культивировали и поддерживали в среде DMEM F12, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина, и инкубировали при 37 °C 5%_CO2. Как только было достигнуто 70-80% слияние клеток, их отделяли с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА и ресуспендировали в той же среде, которая была описана выше.
5. Окрашивание раковых клеток с помощью CFSE путем добавления 1 мкл CFSE на мл среды и оставление окрашиваться при RT на 10 минут. После окрашивания центрифугировать при 450 x g при 4 °C в течение 5 мин, затем отбросить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в исходном объеме среды до получения концентрации 2 x10⁴ раковых клеток на 100 μл среды.
6. После 1 часа блокировки НВЛ осторожно отсасывайте блокирующий раствор и добавьте 2 x10⁴ раковых клеток в среду, что эквивалентно 100 μл, на лунку монослоя NET и дайте ему прилипнуть в течение 90 минут при 37 °C 5%_CO2. Аккуратно аспирируйте клетки и добавьте 100 μл PBS в каждую лунку, чтобы промыть любые неадгезивные клетки.
7. В некоторые лунки добавьте 1000U ДНКазы I в лунку в течение 10 минут перед промывкой для разложения НВЛ. Это послужит негативным контролем. В другие лунки добавьте 100 μл стерильной воды на лунку в течение 10 минут, которая будет служить в качестве управления транспортным средством (VC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно выполняется 3 повторения для каждого условия для увеличения размера выборки.
8. Аспирируйте и отбракуйте все растворы в лунках, оставляя на дне только НВЛ и адгезивные раковые клетки. Добавьте 100 μл 4% раствора формальдегида на лунку для фиксации адгезивных раковых клеток к NETS и прочитайте анализ под флуоресцентным микроскопом (рис. 1). Постройте график и проанализируйте результаты (рис. 2).

Результаты

Рисунок 1. Монослой NET. Световые микроскопические изображения 96-луночных лунок, покрытых НЭО, показывают (А) равномерный монослой НЭО по всей лунке в отличие от (В) неадекватного покрытия лунки прерывистым слоем НВЛ. Масштабные линейки представляют собой 40 мкм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (PBS), модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния	зубр	311-425-CL
RPMI-1640 Среда с L-глютамином	зубр	350-000-КЛ	3% раствор RPMI получают путем дополнения RPMI 3% сывороткой плода крупного рогатого скота
BD Pharm Lyse Лизирующий буфер	BD Biosciences	555899
ДНКаза1	Рош	11284932001
F12 DMEM	зубр	319-075-КЛ
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	зубр	080-150
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140-122
CFSE	Инвитроген	С1157
0,25% Трипсин-ЭДТА	Gibco	No 25200-056