Окрашивание бактериальных клеток и подготовка к иммунологическим исследованиям

Аннотация

Источник: Yang, J. et al., Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериального прилегания к клеткам хозяина.J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует окрашивание и подготовку бактериальных клеток к иммунологическим исследованиям с использованием красного флуоресцентного красителя. Окрашенные бактерии разбавляют и ресуспендируют в питательной среде для достижения желаемой бактериальной концентрации для инфекции клетки-хозяина, представляющей кратность инфекции.

Протокол

1. Рост и окрашивание бактерий

1. Выполняйте все работы с бактериями в кабинете биобезопасности, лаборатории уровня биобезопасности 2.
2. Инокулируйте все бактериальные культуры, включая Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis и др., из замороженного глицеринового сырья и выращивайте их в триптическом соевом бульоне (TSB, 3 мл) в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи при температуре 250 об/мин.
3. На следующий день используйте разведение культуры в соотношении 1:100 для инокуляции субкультуры и выращивайте ее в TSB (1 мл) в течение 3 часов до экспоненциальной фазы, измерьте оптическую плотность, OD на длине волны 600 нм (OD₆₀₀) для подтверждения. Убедитесь, что OD₆₀₀ находится в диапазоне 0,4-0,6.
4. Перед проведением анализа на адгезию бактерии-хозяина планшеты проводят серийные разведения бактериальной суспензии на планшетах TSB-агара, инкубируют их в течение ночи при 37 °C, а затем формируют бактериальные колониеобразующие единицы, КОЕ из числа колоний. Для P. aeruginosa OD₆₀₀, равный 1,0, соответствует 2 x 10⁸ жизнеспособным бактериальным клеткам/мл, а для L. monocytogenes OD₆₀₀, равный 1,0, соответствует 9 x 10⁸ жизнеспособным бактериальным клеткам/мл.
5. Соберите бактериальные культуры в экспоненциальной фазе центрифугированием при 13 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре (RT), затем промойте их один раз с использованием 1x фосфатно-солевого буфера (PBS 1 мл). Ресуспендируйте бактериальные гранулы в 1 мл 1x PBS и определите концентрации, измеряя наружный диаметр₆₀₀ бактериальных суспензий. Например, P. aeruginosa с OD₆₀₀ 0,5 представляет собой концентрацию 1 x 10⁸ бактериальных клеток/мл.
6. Окрашивайте бактериальную суспензию зеленым или красным флуоресцентным красителем в режиме RT в течение 30 минут с осторожным вращением в темноте. Для этого добавьте 2 мкл 500-кратного концентрированного стокового красителя в 1 мл бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в 1 раз. Чтобы смыть краситель, центрифугируйте окрашенные бактерии при 13 000 x g в течение 2 минут и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBS три раза><. заметка: Если в эксперименте используются бактерии, меченные флуоресценцией (зеленый флуоресцентный белок (GFP-), красный флуоресцентный белок (RFP-), mCherry- и т.д.), то пропустите этот этап бактериального окрашивания. В этом протоколе использовали меченный GFP P. aeruginosa и окрашенный красным флуоресцентным красителем L. monocytogenes.
7. Соберите окрашенные бактериальные клетки или бактерии, помеченные GFP, путем центрифугирования при 13 000 x g в течение 2 мин. Ресуспендируйте в свежей среде F-12K (1 мл) и измерьте внешний диаметр₆₀₀ для каждой культуры. Последовательно разбавляйте культуры до желаемых концентраций на основе кратности инфекции (MOI) и концентрации клеток хозяина. Конечный объем, использованный в этом эксперименте, составляет 500 μл.<бр/> заметка: Например, если концентрация клетки-хозяина, подсчитанная с помощью окрашивания Trypan Blue, составляет 1 x 10⁵ клеток/мл, то желаемая концентрация бактериальных клеток при MOI 100 будет составлять 1 x 10⁷ клеток/мл. Концентрация P. aeruginosa при 0,5 OD₆₀₀ составляет 1 x 10⁸/мл. Для получения желаемой концентрации культуру P. aeruginosa разбавляют в 10 раз, и добавляют 50 мкл ресуспендированной культуры к 450 мкл свежей среды F-12K.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x PBS	ВВР	45001-130
BactoView Live Red	Биотиум	40101	Укрепляющий краситель для бактерий
центрифуга	Эппендорф	5810Р
Кишечная палочка			Лабораторный фонд
F-12k средний	АТКС	302004	Среда для культивирования клеток A549
Фетальная бычья сыворотка	Корнинг	35-016-СВ
L. monocytogenes			Коллекции NIST
OD600 DiluPhotometer	ИМПЛЕМЕНТАЦИЯ
P. aeruginosa			Лабораторный фонд доктора Лори Берроуз
P. aeruginosa ΔpilA			Лабораторный фонд доктора Лори Берроуз
С. agalactiae			Коллекции NIST
Золотистый S. aureus	БЭИ	НР-46543
S. aureus ΔsaeR	БЭИ	НР-48164
С. rubidaea			Коллекции NIST
Типичный соевый бульон	Гроуклеоттинги	МБПЭ-4040