Определение связывания витронектина с бактериальными поверхностями с помощью проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Singh, B. et al., Анализы для изучения роли витронектина в бактериальной адгезии и резистентности сыворотки.J. Vis. Exp.(2018)

Это видео демонстрирует обнаружение взаимодействия витронектина с бактериальными поверхностными белками. С помощью анализа проточной цитометрии измеряется сигнал флуоресценции флуоресцентно меченых антител, связанных с витронектином, подтверждая его присутствие на поверхности бактерии. Этот метод дает представление о взаимодействии хозяина и патогена и потенциальной терапии бактериальных инфекций.

Протокол

1. Анализ витронектина, Vn в качестве бактериального поверхностного белка-лиганда

1. Определение Vn-связывания на поверхности бактерии с помощью проточной цитометрии
   заметка: В проточной цитометрии мы использовали боковое рассеяние и прямое рассеяние для затворных положительных событий. Для изучения взаимодействия с Vn, Haemophilus influenzae типа f, клинические изоляты Hif (n=10) были выбраны вместе с E. coli BL21 (DE3) в качестве отрицательного контроля (рис. 1A).
   1. Культуру Hif клинически изолятирует в среде инфузии мозг-сердце (BHI) с добавлением 10 мкг/мл никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и гемина при 37 °С с встряхиванием при 200 об/мин. Используйте среду Лурия-Бертани для культивирования кишечной палочки. Соберите Hif в середине логарифмической фазы (оптическая плотность, OD₆₀₀ = 0,3) и ресуспендируйте бактерии в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2, содержащем 1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) (блокирующий буфер; PBS-BSA). Отрегулируйте суспензию на 10⁹ колониеобразующих единиц, КОЕ/мл.
   2. Переложите аликвоты, содержащие 5 x 10⁶ КОЕ, в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл (12 x 75^мм2) и добавьте 1 мл блокирующего буфера. Центрифугируйте суспензию при 3 500 × г при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут, чтобы гранулировать бактерии, затем осторожно аспирируйте, чтобы удалить надосадочную жидкость, не нарушая гранулы.
   3. Ресуспендируйте бактериальные гранулы 50 мкл блокирующего буфера, содержащего 250 нМ Vn, и инкубируйте образцы в течение 1 ч в режиме РТ без встряхивания. После инкубации гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 3500 x g в течение 5 минут, затем трижды промойте гранулы с помощью PBS и аналогичных этапов центрифугирования.
   4. К бактериальной грануле добавьте 50 мкл первичных поликлональных антител (pAb) против человека Vn (pAb) в соотношении 1:100 в PBS-BSA. Инкубируйте суспензию в течение 1 ч при РТ, затем трижды промойте бактерии PBS для удаления несвязанных антител (как описано в шаге 1.1.3).
   5. Затем добавьте 50 μL PBS-BSA, содержащего флюоресцеин изотиоцианат (FITC)-конъюгированный осенний pAb против овец (разведение 1:100) и инкубируйте при RT в течение 1 часа в темноте.
   6. Приготовьте заготовку для контроля путем инкубации бактерий только с блокирующим буфером и pAb без Vn.
   7. Промойте бактерии три раза 1 мл блокирующего буфера и гранулируйте суспензию центрифугированием, как описано в разделе 1.1.2. Наконец, ресуспендируйте бактериальную гранулу 300 мкл PBS и проанализируйте ее с помощью проточной цитометрии.

Результаты

Рисунок 1: Haemophilus influenzae серотипа f связывается с Vn через поверхностно-экспрессируемую PH.(A) Результаты проточной цитометрии, показывающие связывание Vn с клетками клинических изолятов Hif. Каждый клинический изолят (5 x 10,⁶ КОЕ) инкубировали с 250 нМ человеческого Vn. Связанный лиганд детектировали с использованием анти-Vn pAb овец и ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубка из полистирола с круглым дном 5 мл	BD Falcon	60819-138	12 × стиль 75 мм
Бычьи сывороточные альбумины (BSA)	Сигма-Олдрич	А2058	Подходит для культивирования клеток
Проточный цитометр	BD Biosciences	651154	Класс клеточного анализа для исследовательских целей
Витронектин (Vn) из плазмы крови человека	Сигма-Олдрич	В8379-50УГ	Сорт клеточной культуры
Хозяин кишечной палочки (E. Coli BL21)	Новаген	69450-3	Хозяин экспрессии белка
FITC-конъюгированные антитела к овцам	AbD Serotec	STAR88F	Поликлональные
Антитела к Vn овцы	AbD Serotec	АХП396	Поликлональные