Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Препарат антигена для подкожного введения
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом отделении, в химическом вытяжном шкафу для предотвращения вдыхания или контакта с кожей порошком Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Обращайтесь в соответствии с политикой вашего учреждения для полного адъюванта Фрейнда (обычно BSL-1). Это включает в себя использование химически стойких перчаток, защитных очков и защитной рабочей одежды (лабораторного халата).
- Используйте хорошую стерильную технику, чтобы предотвратить загрязнение реагентами, которые будут вводиться подопытным животным.
- Приготовьте суспензию Mtb в PBS, смешав 5 мг лиофилизированного, убитого при нагревании порошка M. tuberculosis H37Ra с 2,5 мл холодного PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 5 мл. Сделайте вихрь один раз на 30 секунд и затем поместите на лед.
- Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, ультразвуком обрабатывайте суспензию на льду в течение 5 минут.
- Разжмите корпус блока преобразователя и очистите щуп 70% спиртовым тампоном.
- Включите ультразвуковую аппарат, установите мощность на 4, повернув ручку регулировки питания, и погрузите наконечник зонда в порошок микобактерий, содержащий PBS. Убедитесь, что наконечник зонда погружен по крайней мере на половину глубины образца и что наконечник зонда не касается стенки микроцентрифужной пробирки.
- Обрабатывайте смесь ультразвуком на льду в течение 30 секунд, сделайте паузу в течение 30 секунд и повторяйте в общей сложности 5 минут, чтобы полностью диспергировать порошок в однородную суспензию без нагрева жидкости.
- Добавьте в смесь 2,5 мл неполного адъюванта Фройнда и повторяйте процесс ультразвука на льду до тех пор, пока эмульсия не образует консистенцию, похожую на зубную пасту.
- Установите мощность на 0 с помощью ручки управления и выключите устройство, чтобы завершить ультразвуковую обработку. Снимите наконечник с суспензии и протрите щуп спиртовым тампоном.
- Храните антигенную эмульсию при температуре 4 °C. Приготовление партий эмульсии поможет обеспечить согласованность между экспериментами. Эмульсия может храниться при температуре 4 °C до 3 месяцев.
2. Подкожная инъекция
- Выполните подкожную инъекцию за неделю до интравитреальной инъекции (обозначается как день -7).
- Загрузите микобактериальную эмульсию в шприц объемом 1 мл (без иглы). Из-за вязкости и непрозрачности эмульсии трудно различимые пузырьки воздуха могут заполнять шприц.
- Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в шприце, после загрузки 0,2-0,3 мл эмульсии переверните шприц кончиком вверх и осторожно постучите шприцем несколько раз по краю прилавка, чтобы вывести пузырьки на поверхность.
- Выдавите воздух из шприца и продолжайте наполнять шприц. Переверните и периодически постукивайте до полного заполнения.
- Поместите иглу 25 г на шприц и направьте эмульсию до заполнения иглы. Храните шприц на льду до использования.
- Чтобы безопасно выполнить подкожную инъекцию, либо обезболите мышь, либо используйте гуманные методы сдерживания, которые обеспечивают легкий доступ к задним конечностям животного.
- Для обезболивания для подкожного введения поместите животное в индукционную камеру изофлурана (3%-4% для индукции и 1%-3% для поддержания). После обезболивания убедитесь, что у мыши медленный темп дыхания и нет признаков респираторного дистресса.
- Подкожные инъекции следует делать либо на тыльную поверхность бедер, либо на вентральную поверхность ног, расположенную проксимальнее области паховых лимфатических узлов.
- Осторожно введите иглу, чтобы предотвратить инъекцию в мышцу. Введите 0,05 мл эмульсии Mtb в подкожное пространство. Не удаляйте иглу сразу, чтобы дать возможность полностью впрыснуть густую эмульсию.
- Повторите инъекцию с левой и правой стороны в общей сложности 0,1 мл на животное.
- Если мышь находится под наркозом, положите ее на теплую грелку до полного выздоровления. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
- После полного выздоровления верните мышь в клетку и пометьте карту клетки датой подкожной инъекции.
- Обеспечьте обезболивание пероральным ацетаминофеном (200 мг/кг/сут), но не НПВП, так как противовоспалительные средства могут влиять на индукцию увеита.
3. Препарат антигена для интравитреального введения
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях, чтобы предотвратить контаминацию интравитреальной суспензии Mtb.
- Делают интравитреальные суспензии.
- Для индукции панувеита легкой и средней степени тяжести приготовьте интравитреальную суспензию в концентрации 5 мг/мл, добавив 5 мг экстракта микобактерий к 1 мл 1x PBS.
- Для индукции умеренного и тяжелого панувеита приготовьте интравитреальную суспензию в концентрации 10 мг/мл, добавив 10 мг экстракта микобактерий в 1 мл 1x PBS.
- Сделайте вихрь один раз на 30 секунд и затем поместите на лед.
- Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, ультразвуком обрабатывайте суспензию на льду в течение 10 минут, как описано в шаге 1.4. Распределите этот стоковый раствор в объеме 100 мкл и храните при температуре -20 °C.
- Перед использованием размораживайте при комнатной температуре и делайте вихри на высокой мощности в течение 1 мин. Держите аликвоты на льду во время транспортировки их в помещение для животных.
4. Процедура интравитреальной инъекции в день 0
- Подготовка животных
- Наденьте подогнанные смотровые перчатки и положите мышь на весы, чтобы узнать ее вес в граммах.
- Введите внутрибрюшинную инъекцию 0,02 мл/г массы тела раствора, содержащего 100 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина, смешанного со стерильной водой, для обезболивания животного. Альтернативный подход включает индукцию с использованием ~1,5% изофлурана (ингаляционного).
- Подождите примерно 2 минуты, пока мышь заснет, а затем поместите мышь в грелку и накройте крышкой. Проведите тесты на болевой рефлекс, такие как щипывание ушей, пальцев ног и хвоста, чтобы оценить глубину анестезии для процедуры.
- После сна обезболите роговицу 1 каплей 0,5% (v/v) тетракаина. Избегайте попадания тетракаина в нос или рот мыши. Через 10 секунд промокните лишнюю жидкость.
заметка: Было замечено, что дилатация радужной оболочки и визуализация передней камеры (ПК) улучшаются при применении местной анестезии, возможно, за счет улучшения подавления роговичного рефлекса при комбинированной системной и местной анестезии. Однако при желании этот шаг можно опустить.
- Расширьте зрачок с помощью 1 капли 2,5% (v/v) фенилэфрина. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать попадания излишков капель в нос или рот. Через 2-3 минуты смочите лишнюю жидкость.
- Чтобы снизить риск развития эндофтальмита, добавьте 1 каплю 5% бетадина на поверхность глаза и окружающие волосы. Оставить на глаз на 2-3 мин.<бр/>
заметка: Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях для профилактики эндофтальмита.
- Удалите бетадин и покройте глаз гипромеллозой (0,3%) или карбомерным гелем для глаз 0,2% по мас., чтобы предотвратить сухость под анестезией. Это также поможет предотвратить образование катаракты.
- Настройка системы микровпрыска
- Выполните интравитреальную инъекцию с помощью микронасоса, подключенного к контроллеру микрошприцевого насоса и инъекционному шприцу (рис. 1A-C). В качестве альтернативы можно ввести иглу 33 G, прикрепленную к шприцу Hamilton, как описано в подразделе 4.4.
- Подсоедините иглу 34 G к держателю для инъекций, чтобы собрать инжектор. Ослабьте серебряную винтовую крышку на переднем конце держателя для инъекций и вставьте иглу в корпус держателя примерно наполовину. Плотно затяните серебряный завинчивающийся палец.
- Подсоедините трубку к держателю для впрыска, как указано в шагах 4.2.4-4.2.5.
- Чтобы вставить трубку в держатель для впрыска, ослабьте пластиковый винт на заднем конце держателя, проденьте трубку через прокладку внутрь и затяните винт.
- Поддерживайте небольшой зазор с концом трубки, чтобы предотвратить повреждение трубки во время впрыска. Обратитесь к рисунку 1С.
- Разморозьте 100 мкл аликвоты бульонной суспензии микобактерий.
- Добавьте 3 мкл 1% раствора флуоресцеина натрия (AK-Fluor) и хорошо
перемешайте.
- Загрузите в шприц объемом 10 мкл смесь антигена и флуоресцеина, не добавляя пузырьков воздуха.
- Извлеките загрузочную иглу из шприца и проденьте трубку через серебряную прокладку винтовой крышки до тех пор, пока наконечник не достигнет нулевой отметки в корпусе шприца.
- После того, как кончик трубки будет правильно выровнен в нужном положении, плотно затяните палец завинчивающейся крышки.
- Промывайте раствор в шприце через инъекционную трубку, чтобы полностью загрузить систему. Затем повторите шаги 4.2.8-4.2.11 для перезарядки шприца для инъекции.
- Чтобы установить заряженный шприц на микропомпу, нажмите кнопку разблокировки зажима на конце микропомпы, чтобы открыть зажимы шприца.
- Поместите колпачок поршня в держатель колпачка плунжера на заднем конце микронасоса.
- Затем наденьте хомут шприца на упор хомута и корпус шприца в зажим шприца.
- Отпустите кнопку зажима и затяните стопорный винт поршня. Обратитесь к рисунку 1D.
- Проденьте держатель инъекции и иглу через уплотнительный зажим на стереотаксическом аппарате для инъекций. Это кастомная платформа; Кроме того, шприц можно удерживать и позиционировать вручную.
- Установите объем инфузии и скорость объема инфузии на контроллере микрошприцевого насоса для впрыскивания 500 нл за цикл со скоростью 40 нл/с соответственно.
заметка: Можно использовать более высокую скорость инъекций, однако может возникнуть больший рефлюкс, прежде чем будет достигнуто изменение положения иглы.
- Перед выполнением интравитреальной инъекции протестируйте систему на предмет ее правильного функционирования.
заметка: Когда система впрыска функционирует правильно, активация цикла впрыска с помощью ножной педали или панели управления вызовет видимое движение держателя колпачка поршня, а на кончике иглы будет видна небольшая капля зеленоватой жидкости. В том случае, если жидкость не вырабатывается, активируйте дополнительные циклы или промойте и зарядите шприц заново.
- Перед введением глаза аккуратно протрите иглу подушечкой из 95% этанола.
- Процедура интравитреального введения
- Мышь помещается на стереотаксический аппарат для выполнения процедуры инъекции.
- Держите сцену/платформу, на которой лежит мышь, в тепле, приложив к ее поверхности 2-3 бумажных полотенца.
- Поместите мышь в положение лежа на платформе. Используйте правую и левую ушные планки, чтобы аккуратно зафиксировать голову животного. Обратитесь к рисунку 1E.
- Расположите мышь и расположите ее под эндоскопом так, чтобы была видна верхняя носовая часть правого глаза.
- С помощью иглы 30 G сместите ресницы и обнажите склеру. Визуализируйте лимб и лучевой кровеносный сосуд.
- С помощью стерильной иглы 30 G сделайте направляющее отверстие в склере на 1-2 мм позади лимба.
- Вставьте иглу 34 G, прикрепленную к держателю для инъекций, в глаз через направляющее отверстие под углом, который позволит избежать линзы, но поместить кончик иглы в полость стекловидного тела.
- С помощью контроллера микрошприцевого насоса осторожно введите 1 мкл экстракта Mtb в полость стекловидного тела. В случае постоянного рефлюкса увеличьте объем инъекции до 1,5 мкл для обеспечения адекватной доставки дозы.
заметка: Для фиктивного контроля введите 1 мкл PBS в глаз животного.
- Проверьте интравитреальное размещение путем визуализации зеленоватого рефлекса в глазу. Обратитесь к рисунку 1F.
- Через 10 с извлеките иглу из ушка. Обратите внимание на любой рефлюкс.
- Снимите мышь с платформы, нанесите 0,3% гипромеллозы или 0,2% мази для глаз с карбомером на оба глаза для защиты роговицы и переместите в коробку для восстановительного согревания.
- Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не возвращайтесь в компанию других животных до полного выздоровления.
- Когда мышь полностью придет в себя, вернитесь в клетку и добавьте в нее ацетаминофен (200-300 мг/кг/день) лечебную бутылку с водой. Пометьте карточку кейджа датой инъекции ИВТ.
- Интравитреальные инъекции, как правило, хорошо переносятся. Клинические признаки, которые могут указывать на боль и необходимость удаления из исследования, включают периокулярную алопецию (свидетельствующую о самотравме), изъязвление роговицы, потерю веса и сгорбленную осанку.
- Альтернативный метод интравитреального введения
заметка: Эта процедура выполняется с помощью операционного микроскопа и иглы 33 G на микрошприце.
- Проптозаните глаз и удерживайте его в нужном положении с помощью щипцов.
- Затем нанесите карбомерный гель для глаз 0,2% w/w или 0,3% гипромеллозный гель для глаз и наложите на глаз круглую покровную накладку (диаметром 7 мм).
- Установите иглу для подкожных инъекций 33 G на шприц Hamilton объемом 5 мкл и введите ее примерно на 2 мм в окружность роговицы с углом инъекции ~45°.
- Направьте скос иглы в стекловидное тело, остановившись между линзой и диском зрительного нерва (с относительной точки зрения хирурга, это над/покрытием диска зрительного нерва - примерно в 1,5 мм от места введения), и медленно введите 2 мкл Mtb (при концентрации 2,5 мкг/мкл в PBS).
- Ненадолго удерживайте иглу на месте (чтобы уменьшить количество рефлюкса инъекции), а затем извлеките ее.
- После инъекции поместите в положение глобус, освободив щипцы. В это время в глаз можно ввести каплю 1% мази с хлорамфениколом для обеспечения дополнительной защиты от постинъекционного эндофтальмита.
- После впрыска переместитесь в восстановительный согревающий бокс, как указано в шагах 4.3.11-4.3.13.
5. ОКТ-визуализация для обнаружения и количественной оценки увеита
- Подготовка животных
- Обезболите мышь, как описано в шагах 4.1.2-4.1.4
- Расширить зрачок с помощью 1 капли 2,5% фенилэфрина. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать попадания излишков капель в нос или рот. Через 2-3 минуты смочите лишнюю жидкость.
- Поместите 0,3% гипромеллозы или 0,2% без карбомергеля на глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Это также поможет предотвратить образование катаракты.
- Оберните мышь слоем хирургической марли, чтобы сохранить тепло тела, и поместите ее на кассету для животных. Расположите голову с помощью прикусочной планки.
- Получите ОКТ-изображения передней и задней камер.
заметка: При получении изображений передней и задней камер сначала получите изображения задней камеры (ПК), чтобы предотвратить ухудшение изображения после образования катаракты. Образование катаракты можно предотвратить с помощью частой смазки и нанесения 0,3% гипромеллозы или 0,2% без карбомерного геля для глаз. При длительном изображении (>10 мин) также помогает держать мышь в тепле (с помощью грелки).
- После включения системы ОКТ-визуализации закрепите правильную линзу визуализации и при необходимости отрегулируйте положение контрольного рычага.
- Откройте программное обеспечение для визуализации, создайте уникальный идентификатор мыши и начните визуализацию в соответствии с протоколом производителя ОКТ.
- Используя опцию Free Run с протоколом быстрого сканирования, расположите глаз так, чтобы зрительный нерв был центрирован на изображениях задней камеры или верхушка роговицы на изображениях передней камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 содержит параметры протокола визуализации для двух коммерчески доступных систем визуализации мелких животных. Технические характеристики продукции см. в Таблице материалов.
- Для визуализации задней камеры поднесите ОКТ близко к поверхности глаза. Соблюдайте осторожность, чтобы поверхность линзы не соприкасалась с глазом.
- После того, как глаз будет правильно расположен, остановите быстрое сканирование, выберите протокол объемного сканирования и активируйте сканирование с помощью опции «Прицелиться».
- Для изображений заднего сегмента корректируйте до тех пор, пока зрительный нерв не будет центрирован на изображении горизонтального B-сканирования, а сетчатка не будет выровнена по оси вертикального выравнивания
- Для изображений переднего сегмента отрегулируйте положение, чтобы центрировать верхушку роговицы как на горизонтальном изображении B-Scan Alignment, так и на изображении Vertical Alignment B-Scan Alignment. Наличие артефакта отражения на обоих изображениях подтвердит правильное выравнивание. Затем сдвиньте изображение по горизонтали настолько, чтобы убрать артефакт отражения. Обратитесь к рисунку 2.
- Нажмите «Моментальный снимок», чтобы получить изображение сканирования тома, а затем нажмите «Сохранить».
- Затем получите усредненное сканирование центральной линии. Откройте протокол сканирования и нажмите «Прицелиться», а затем «Снимок». Щелкните правой кнопкой мыши на той же панели, а затем нажмите на «Среднее».
- Повторите шаги 5.2.1-5.2.9 для каждого глаза с обеими линзами.
- После того, как все изображения будут собраны, извлеките мышь из кассеты и обеспечьте защиту роговицы во время восстановления, как указано в шагах 4.3.11-4.3.13.
6. Оценка воспаления с помощью ОКТ
- Оценивайте ОКТ-изображения с помощью сортировщиков, которые маскируются под условия лечения.
заметка: Для PMU в модели мыши рекомендуется использовать систему оценки, представленную в таблице 2.
- Если были получены изображения как передней камеры (ПК), так и задней камеры (ПК), объедините эти оценки, чтобы получить окончательную оценку для каждого глаза.
заметка: Воспаление передней камеры проходит до воспаления задней камеры.
Таблица 1: Параметры сканирования. (А) Параметры ОКТ-сканирования. (B) Параметры сканирования глазного дна/ОКТ сетчатки
шт.
шт.
| a | | | |
| Передняя камера мыши | Быстрое сканирование | Объемное сканирование | Линейное сканирование |
| Длина X Ширина | 4,0 мм x 4,0 мм | 3,6 мм x 3,6 мм | 3,6 мм |
| угол | 0 | 90 | 90 |
| А-скан/Б-скан | 800 | 1000 | 1000 |
| # Б-сканы | 50 | 400 | 1 |
| Рамки/ B-скан | 1 | 3 | 20 |
| Задняя камера мыши | Быстрое сканирование | Объемное сканирование | Линейное сканирование |
| Длина X Ширина | 1,6 мм x 1,6 мм | 1,6 мм x 1,6 мм | 1,6 мм |
| угол | 0 | 0 | 0 |
| А-скан/Б-скан | 800 | 1000 | 1000 |
| # Б-сканы | 50 | 200 | 1 |
| Рамки/ B-скан | 1 | 3 | 20 |
| В | | | |
| Задняя камера мыши | Объемное сканирование | Линейное сканирование | |
| Длина X Ширина | 0,9 мм x 0,9 мм | 1,8 мм | |
| угол | 0 | Любой (обычно 0 или 90) | |
| А-скан/Б-скан | 1024 | 1024 | |
| # Б-сканы | 512 | 1 | |
| Рамки/ B-скан | 1 | 30 | |
Таблица 2: Критерии оценки ОКТ PMU: изображения ОКТ оцениваются в соответствии с критериями, перечисленными в таблице. Для получения итоговой оценки глаза добавляются баллы AC и PC. В тех случаях, когда четкое изображение глаза не было получено, изображениям присваивалась оценка NA, и они были исключены из исследования.
воде
| Описание оценки OCT |
| счёт | Передняя камера | Задняя палата |
| NA | Нет вида за пределы передней роговицы | Нет вида на задний сегмент |
| 0 | Отсутствие воспаления | Отсутствие воспаления |
| 0.5 | 1–5 ячеек в водной | Небольшое количество клеток, занимающих менее 10% площади стекловидного тела |
| ИЛИ отек роговицы | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки |
| 1 | 6–20 ячеек в водной | Диффузные клетки (без плотных скоплений) занимают от 10 до 50% площади стекловидного тела. |
| ИЛИ один слой клеток на передней капсуле хрусталика | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки |
| 2 | 20–100 клеток в водной воде | Диффузные клетки (без плотных комков), занимающие > 50% площади стекловидного тела |
| ИЛИ менее 20 клеток и присутствует гипопион | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки |
| 3 | 20–100 клеток в водной воде | Диффузные ячейки, равные 2 и 1 классам |
| И гипопион ИЛИ зрачковая оболочка | И по крайней мере одна плотная помутнение стекловидного тела, занимающая 10–20% площади стекловидного тела ИЛИ наличие клеток стекловидного тела 2 степени и редких (≤ 2) субретинальных или интраретинальных помутнений |
| 4 | Любое количество водных ячеек | Плотное помутнение стекловидного тела, занимающее > 20% площади стекловидного тела. |
| И большой гипопион и зрачковая оболочка ИЛИ потеря передней структуры из-за сильного воспаления | ИЛИ диффузные клетки стекловидного тела с большими субретинальными или интраретинальными помутнениями |
