Оценка внутриклеточного фосфорилирования стромальных цитокинов с помощью фосфопроточной цитометрии

Аннотация

Источник: Coats, J. S., et al. Экспрессия экзогенных цитокинов в ксенотрансплантатах, полученных от пациента, путем инъекции с трансдуцированной цитокином стромальной клеточной линией. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Это видео демонстрирует оценку внутриклеточного фосфорилирования белков в клетках лейкемии, индуцированного стромальными цитокинами. Эти внутриклеточные фосфорилированные белки количественно оцениваются с помощью метода фосфопроточной цитометрии.

Протокол

1. Фосфо-проточная цитометрия для оценки активности цитокинов, продуцируемых стромой

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените надосадочную жидкость из сконструированной стромы перед первым экспериментом, чтобы проверить соответствующую биологическую активность цитокина, сгенерированного стромой, для отдельного эксперимента. После того, как сконструированная строма проверена, дальнейшие испытания не требуются, если только не будут введены стромы, которые были получены с новым вектором.

1. Приобретите клеточные линии лейкоза MUTZ5 и/или MHH-CALL4 (реагирующие на TSLP), рекомбинантные цитокины человека и антитела, одобренные для использования в анализах фосфопроточной цитометрии для выявления соответствующих мишеней фосфорилирования в нисходящем потоке.
2. Разморозьте собранную надосадочную жидкость из контроля и цитокин-экспрессирующую строму.
3. Пластинчатые клеточные линии лейкоза помещают в среду R20 (см. Таблицу материалов) в концентрации 0,2 x 10⁶ клеток на лунку в 96-луночном тканевом планшете. Планшет 3 лунки для каждого состояния, чтобы можно было провести тройные анализы. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C. Это время позволяет потерять любое фосфорилирование, которое произошло в предшествующих условиях культивирования.
   Примечание: 12 лунок на клеточную линию обеспечивают тройной анализ для каждого экспериментального условия, показанного на шаге 1.4.
4. После 2 ч в культуре перенесите клетки из каждой лунки в отдельные пробирки объемом 4 мл и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость.
   1. Ресуспендирование клеток в 200 мкл для каждого из следующих экспериментальных условий (проводите анализ в трех экземплярах): 1) только отрицательная контрольная среда, 2) положительная контрольная среда с рекомбинантными цитокинами в насыщающей концентрации (TSLP в концентрации 15 нг/мл и т.д.), 3) контрольная строма-супернатант из контрольной стромы и 4) цитокин-строма-супернатант из цитокин-продуцирующей стромы.
5. Инкубируйте клетки в течение времени, указанного в конкретном коммерческом фосфоанализе (например, 30 минут для фосфо-STAT5 в MUTZ5 или MHH-CALL4 в ответ на TSLP).
6. Центрифугировать при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C и сцедить надосадочную жидкость.
7. Выполните окрашивание фосфопроточной цитометрией в соответствии с протоколом производителя и соберите данные проточной цитометрии.
8. Анализируйте данные проточной цитометрии.
   1. Затвор на интактных клетках основан на прямом (FSC, указывает на размер ячейки) и боковом (SSC, указывает на зернистость клетки) рассеянии света.
   2. Определите медианную интенсивность флуоресценции (MFI) интактных клеток в каждом образце. Сравните среднее значение MFI, полученное из тройных значений супернатанта стромальных клеток, с положительным и отрицательным контролем среды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Серологические пипетки объемом 10 мл	сокол	357551
Полипропиленовые конические пробирки 15 мл	рыбак	Тел.: 05-539-12
Полипропиленовые конические пробирки 50 мл	сокол	352098
Наконечники для пипеток объемом 1 мл	рыбак	2707509
Наконечники для пипеток 200 мкл	Денвилл Сайентифик	P3020-CPS
Наконечники для пипеток объемом 10 мкл	Денвилл Сайентифик	-1096-КП
Среда для культивирования клеток "R20", % от общего объема (составляет 195 мл)			Лабораторный рецепт
RPMI, 76,84% (150 мл)	Медиатех	10-040-CV
FBS, 20,49% (40 мл)	Медиатех	35-011-ЧВ
2 мМ L-глутамина, 1,02% (2 мл)	Медиатех	35-011-ЧВ
1 мМ Na пируват, 1,02% (2 мл )
Пенициллин-стрептомицин, 0,51% (1 мл	Медиатех	30-002-Кл
2-Меркаптоэтанол, 0,10% (0,1 М), 0,10% (200 μл)	нардеп	190242
Биопрепаратов
Клеточная линия "CALL-4" MHH-CALL-4, предшественник В-клеток человека лейкемия	ДСМЗ	АКК 337
Клеточная линия MUTZ-5, предшественник В-клеток человека лейкемия	ДСМЗ	АКС 490
Рекомбинантный человеческий белок TSLP	Системы НИОКР	1398-ТС-010
Антитела к проточной цитомерии (клон)*
Антимышь CD45 FITC (30F11)	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (альтернативное название - IL-7Rα)	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-098-094
БТР КД34 (8Г12)	BD Biosciences	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBioscience	25-0459
"FVD" Корректируемый краситель для повышения жизнеспособности eFluor 780	eBioscience	Телефонный номер 65-0865
Легкая цепь Ig κ FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ легкая цепь FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	Биолегенда	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biosciences	551079
pSTAT5 PE, мышь анти-STAT5 (pY694)	BD ФосфоФлоу	612567
Прочие материалы и оборудование
Программное обеспечение для анализа проточной цитометрии FlowJo	ООО «ФлоуДжо»	Версия 10
*Если не указано иное, все антитела являются античеловеческими.