$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка тканей к фиксации и заделке парафина
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия была взята у женщин по согласию, проходящих цистоскопию с электрофульгурацией тригонита для расширенного лечения рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей (рИМП). рИМП определяется как 3 ИМП в течение 12 месяцев. Забор биопсии проводился в операционной, когда пациент находился под наркозом после получения информированного согласия пациента. Все образцы были закодированы и обезличены перед экспериментом.
- С помощью гибкого цистоскопа с помощью гибкого цистоскопа проводят биопсию холодовой чашечки (~1мм3) из тригона мочевого пузыря и немедленно помещают в стерильный 2-литровый криоциал, содержащий 1,5 мл 4% v/v параформальдегида (PFA), приготовленного в 1x стерильном фосфат-буферном физрастворе (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: 4% PFA в 1x PBS может быть изготовлен заранее и храниться при температуре -20 °C до тех пор, пока не понадобится.
- Фиксируют биопсию в течение 6 ч при комнатной температуре или в течение 16-24 ч при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность фиксации следует рассчитывать в зависимости от размера образца ткани, и следует избегать чрезмерной фиксации. Не рекомендуется использовать глутаральдегид в качестве фиксатора, так как он вносит автофлуоресценцию.
- В стерилизованной вытяжке или шкафу биобезопасности снимите фиксатор с помощью пипетирования и замените его 1,5 мл стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Держите образцы при температуре 4 °C в течение ночи или немедленно выполните обработку тканей и заделку парафина.
- С помощью стерилизованного микротома срезы тканевых блоков толщиной 5 мкм и приклейте парафиновые срезы к предметным стеклам заряженного стекла микроскопа. Для протокола флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 16S рибосомальной РНК (16S рРНК) потребуется как минимум два предметных стекла на биопсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань биопсии должна быть расположена в поперечном сечении относительно плоскости разреза, чтобы обеспечить визуализацию уротелиальных слоев на всех срезах. Следует также отметить, что толщина сечения должна быть оптимизирована для обнаружения бактериального сообщества. Более тонкие срезы или отбор проб нескольких серийных срезов могут потребоваться в случае инфекций, когда тканевых резидентных бактерий крайне мало (например, <1 тканевая бактерия на 1000 клеток млекопитающих).
2. Флуоресцентная гибридизация in situ с помощью универсальных зондов 16S рРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется два предметных стекла на биопсию. Одно предметное стекло необходимо для универсального зонда 16S рРНК и одно предметное стекло для контрольного зонда с скремблированной последовательностью. Это важно для того, чтобы отличить истинный сигнал от фонового сигнала во время микроскопии, поскольку эпителий мочевого пузыря является аутофлуоресцентным в нескольких каналах. В дополнение к скрембл-зонду, блокирование 0,1% Sudan Black B перед установкой может снизить фоновую аутофлуоресценцию, присущую ткани.
- Приготовление реагентов и вытяжного шкафа
- Очистите пустой вытяжной шкаф (или надлежащим образом оборудованный шкаф биобезопасности) 70% этанолом.
- Приготовьте гибридизационный буфер, состоящий из 0,9 М натрия хлорида (NaCl), 20 мМ трис (гидроксиметил) аминометан-гидрохлорида (Tris-HCl, pH 7,2), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) в 10 мл стерильно отфильтрованной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильно отфильтрованная вода может быть приготовлена путем пропускания автоклавной дистиллированной воды через фильтр 0,22 мкМ. Буфер для гибридизации может храниться при комнатной температуре, но SDS может выпадать в осадок из раствора. Если SDS выпадает в осадок, нагрейте раствор на водяной бане при температуре 50 °C перед использованием.
- Приготовьте не менее 100 мл 95% и 90% этанола в стерильно фильтрованной воде в вымытых автоклавных бутылках.
- Растворите флуоресцентно меченные лиофилизированные зонды в 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) буфере (TE), приготовленном в стерилизованной фильтром воде, не содержащей нуклеаз, до конечной концентрации 100 мкМ. Приготовьте разведение 1 мкМ в TE-буфере для использования в этом протоколе. Храните концентрированные зонды 100 мкМ и восстановленные зонды 1 мкМ при температуре -20 °C в защищенном от света месте. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Не растворяйте зонды с флуоресцентной маркировкой в воде. Буферизация необходима для предотвращения гидролиза эфирной связи N-гидроксисукцинимида (NHS), конъюгирующей флуорофор с нуклеотидным зондом.
- Очистите пять банок Coplin 70% этанолом (EtOH), дайте высохнуть, наклейте следующую маркировку: ксилолы I, ксилолы II, 95% EtOH, 90% EtOH, воду двойной дистилляции (ddH2O) и залейте 100 мл соответствующего раствора. Это поможет избежать путаницы на последующих этапах.
- Депарафинизация и регидратация тканей
- В капюшоне поместите два предметных стекла для каждой биопсии в вертикальный штатив для предметных стекол.
- Поместите вертикальную решетку для предметных колемок в банку с ксилолами I Coplin (содержащую 100 мл ксилолов) на 10 минут.
- Снимите решетку для слайдов с ксилолов I и промокните дно на бумажном полотенце, чтобы удалить излишки ксилолов. Поместите в банку с коплином для ксилолов II на 10 мин.<бр />
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не работайте с ксилолами вне сертифицированного вытяжного шкафа.
- Регидратируйте депарафинизированные срезы ткани в последовательных промывках этанолом (95% и 90%) в течение 10 мин каждый в соответствующих банках с маркировкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе нагрейте буфер для гибридизации до 50-56 °C на водяной бане.
- Снимите решетку для слайдов с 90% этанолом, промокните дно бумажными полотенцами, чтобы удалить излишки этанола, и поместите в банку ddH2O Coplin, содержащую 100 мл стерилизованного фильтром ddH2O на 10 минут.
- В ожидании стирки ddH2O разбавьте зонды до 10 нМ в буфере для гибридизации для создания раствора для окрашивания. Приготовьте 150 μл раствора для окрашивания на предметное стекло. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор для окрашивания от света, обернув трубки алюминиевой фольгой и храня их в ящике. При работе с датчиками с флуоресцентной маркировкой на настольном столе по возможности отключайте верхнее освещение. Зонды, разведенные в буфере для гибридизации, не должны использоваться повторно.
- Гибридизация и контрокрашивание
- Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, поместив смоченную смятую воду Kimwipe и стерильную воду в резервуар для наконечника P1000. Поместите картридж держателя наконечника сверху - именно там будут сидеть горки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать увлажняющую камеру, чтобы предотвратить высыхание биопсийных участков во время гибридизации. Следует отметить, что коммерчески доступные увлажнители воздуха предназначены для поддержания стабильной, влажной атмосферы. Тем не менее, описанный здесь метод в достаточной степени контролирует влажность при значительно меньших затратах.
- Снимите предметные стекла с решетки для слайдов и положите их на свежее бумажное полотенце (салфеткой вверх). Используйте салфетку Kimwipe, чтобы высушить предметное стекло. Будьте осторожны и аккуратно промокайте только рядом с биопсийным участком (а не на нем), чтобы отвести воду. С помощью гидрофобной ручки очертите границу вокруг биопсийного участка и поместите салфетку стороной вверх в увлажняющую камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы ткани не пересохли перед гибридизацией.
- Поместите увлажняющую камеру в инкубатор, настроенный на 50 °C. Пипеткой нанесите 50-150 μл раствора для окрашивания непосредственно на ткань так, чтобы прямоугольник, образованный гидрофобной границей вокруг ткани, был заполнен. Будьте осторожны, чтобы не добавить слишком много раствора, чтобы перелить гидрофобную границу. Аккуратно закройте коробку.
- Инкубировать в течение ночи (~16 часов) при температуре 50 °C в темноте. Если в инкубаторе есть окно, накройте его алюминиевой фольгой для создания темной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного сигнала требуется температура гибридизации ниже температуры плавления зонда FISH. 50 °C является оптимальной температурой для универсального зонда 16S рРНК, но может быть не оптимальной для других зондов.
- На следующее утро приготовьте не менее 500 мл буфера для промывки, состоящего из 0,9 М хлорида натрия (NaCl) и 20 мМ Tris-HCl (pH 7,2) в ddH2O и отфильтруйте и стерилизуйте в стерильную бутылку с вакуумным фильтром на крышке бутылки. Прогрейте до 50-56 °C на водяной бане.
- Снимите предметные стекла с увлажняющих камер и осторожно смойте остатки гибридизационного раствора с помощью Kimwipe. Поместите предметные стекла в вертикальную решетку для окрашивания.
- Поместите решетку для окрашивания в непрозрачную банку Coplin, содержащую 100 мл предварительно подогретого буфера для стирки, на 10 минут. Если банки Coplin не являются непрозрачными (например, стеклянными), поместите их в темноту на этапе инкубации — возможно, под коробку или в ящик.
- Повторите шаг промывки дважды со свежим буфером Wash в новых банках Coplin.
- На этапах стирки приготовьте противоморилку, разбавив в буфере для стирки 100 мкг/мл стокового раствора Hoechst 33342 1:1,000. В ту же пробирку добавьте агглютинин зародышей пшеницы Alexa-555 (WGA) до конечной концентрации 5 г/мл и фаллоидин Alexa-555 до конечной концентрации 33 нМ. Хранить в темноте до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst, Alexa-555 WGA и Alexa-555 Фаллоидин маркируют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), муцин/уроплакины и актин соответственно и могут храниться в течение длительного времени в темноте в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресцентные метки, используемые для зондов и противопятен, могут быть настроены в соответствии с наборами фильтров, доступными для используемого микроскопа.
- Снимите слайдеры с последней стирки и аккуратно смойте излишки буфера для стирки с помощью салфетки Kimwipe. Положите предметные стекла тканевой стороной вверх на бумажное полотенце и добавьте 50-150 мкл противоморилки непосредственно поверх ткани, чтобы гидрофобная граница была заполнена, но не переполнялась. Накройте до четырех предметных стекол крышкой криобокса и выдерживайте в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Положите бортики обратно в решетку для окрашивания и промойте еще два раза в банках Coplin со свежим буфером для промывки, по 10 минут каждая.
- Тщательно высушите слайды после последней стирки и положите салфеткой вверх на бумажное полотенце под крышку криобокса. Выдавите одну каплю крепежного носителя непосредственно поверх ткани. Аккуратно положите сверху покровную крышку подходящего размера (зависит от размера биопсии). Осторожно выдавите все пузырьки, так как они будут мешать визуализации, и дайте слипнувшимся предметным стеклам застыть в течение ночи в темноте.
- На следующий день заклейте края покровного стекла к предметному стеклу легким слоем прозрачного лака для ногтей. Дайте высохнуть в течение 10 минут в темноте, а затем храните в темноте при температуре 4 °C для конфокальной микроскопии.
3. Визуализация 16S рРНК FISH с помощью конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола наилучшие результаты достигаются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с 63-кратным и 100-кратным объективами. Для визуализации флуоресценции Hoechst, Alexa-488 и Alexa-555 требуются соответствующие наборы фильтров. Тем не менее, стандартная флуоресцентная микроскопия может быть использована, если конфокальный микроскоп недоступен. Этот протокол предназначен для лазерного сканирующего конфокального микроскопа.
- Включите конфокальный микроскоп и компьютерное программное обеспечение, связанное с микроскопом, в соответствии с инструкциями производителя.
- Загрузите слайд и визуализируйте его с помощью объектива 10x в синем канале (Hoechst). Тщательно сосредоточьтесь до тех пор, пока не станут видны ядра.
- После фокусировки измените объектив на большое увеличение (63x или 100x). Добавьте масло поверх покровного стекла. Выполните повторную фокусировку с помощью нового объектива, убедившись, что линза объектива соприкасается с маслом во время фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только тонкую фокусировку при большом увеличении (63x или 100x). Масло следует использовать только для нефтяной цели.
- Быстро оцените каждый слайд через окуляр в зеленом канале (усиленный зеленый флуоресцентный белок, eGFP/Alexa-488), чтобы определить, какие слайды являются положительными для FISH, а какие для FISH отрицатель><ными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, если эта первоначальная оценка/оценка будет проводиться вслепую отдельным человеком, чтобы уменьшить экспериментальную систематическую ошибку.
- Чтобы получить изображение окрашенной биопсии, начните с положительного предметного стекла FISH и переключитесь в режим компьютерной визуализации. Выберите каналы 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) и 555 (Alexa-555). Установите отверстие с использованием самого длинного канала длины волны, в данном случае 555. Найдите правильную фокальную плоскость для визуализации меченых бактерий в канале 488. Не изменяя фокальную плоскость, установите усиление, мощность лазера и смещение для каждого канала таким образом, чтобы сигнал не был насыщен, а фон не подвергался чрезмерной коррекции. Получение изображения по всем трем каналам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же настройки для канала 488 для отображения каждого слайда в эксперименте. Мощность лазера может потребовать регулировки в каналах 405 и 555, если оптимальная фокальная плоскость для визуализации бактерий изменяется между полями.