Метод in vitro для генерации апоптотических Т-клеток с помощью ультрафиолетового облучения

Аннотация

Источник: Hodge, M. X., et al. in vivo оценка эффероцитоза альвеолярных макрофагов после воздействия озона. J. vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует метод индуцирования апоптоза в клетках Jurkat — клеточной линии лейкоза Т-лимфоцитов человека. Клетки подвергаются воздействию ультрафиолетового излучения С (УФС), которое вызывает обширное повреждение ДНК и приводит к апоптотической гибели клеток.

Протокол

1. Подготовка Т-клеточной линии Jurkat (День 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в шкафу биологической безопасности класса II.

1. Культуру Т-клеток Юркат в 24 мл среды базальных клеточных культур + 10% FBS + 5% пенициллин/стрептомицин при 37 °C + 5% CO₂ (таблица материала). Т-клетки Jurkat представляют собой суспензионную клеточную линию, которую можно поддерживать путем пропускания 1:6-1:8 в предварительно подогретую питательную среду каждые 3 дня. Не трясите.
2. Чтобы подготовить апоптотические клетки, вырастите их до 90% конфлюенции в каждой колбе (что занимает 3-4 дня после пассажа). Для этого исследования используйте клетки из пяти колб T75, чтобы получить достаточное количество клеток, используемых в этом протоколе.
   заметка: Конфлюентная колба содержит около 20-24 миллионов клеток.
3. Пипетируйте клетки (то есть целую колбу) из каждой колбы (примерно 24 мл) и переносите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки. Используйте несколько конических трубок для нескольких колб.
4. Подсчитайте клетки, удалив аликвоту 11 мкл клеток из конической пробирки объемом 50 мл, и смешайте с 11 мкл трипанового синего красителя и пипеткой 11 мкл на предметных стеклах гемоцитометра.
5. Вставьте предметное стекло в автоматический счетчик клеток и запишите количество живых клеток, чтобы рассчитать общее количество клеток в каждой колбе, умножив количество живых клеток на 24, так как каждая колба содержит 24 мл среды.
6. Центрифугирование суспензии клеток при давлении 271 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) в грануляционные ячейки.
7. Отбраковать надосадочную жидкость путем аспирации и повторно суспендировать клеточную гранулу в среде до получения 3,0 x 10⁶ клеток на мл.
8. Аликвота 5 мл клеток в чашках для культуры тканей размером 100 мм x 20 мм (будет использовано примерно девять чашек; общее количество клеток в каждой чашке должно быть ~15 x 10⁶).
9. Используйте одну посуду для контроля/без экспонирования, а остальные посуды будут подвергаться воздействию ультрафиолета.
10. Установите УФ-сшиватель на правильный уровень энергии, нажмите кнопку энергии и введите «600» с помощью цифровой клавиатуры, что машина прочитает как 600 μДж/см² x 100,<бр/> заметка: единицы энергии УФ-сшивателя в μДж/см² х 100; следовательно, чтобы достичь 60 миллиджоулей/^см2, преобразуйте единицы в соответствии с УФ-сшивателем.
11. Облучайте все посуды с ячейками, не включая контрольную, со скоростью 60 миллиджоулей (мДж)^/см2 с помощью УФ-сшивателя. Снимите верхнюю крышку посуды для тканевых культур во время воздействия ультрафиолета, так как ультрафиолетовый свет не проникнет через пластиковую крышку.
12. Инкубировать все чашки в инкубаторе для клеточных культур, включая контроль, при температуре 37 °C при 5%_CO2 в течение 4 ч.
13. Подтвердите апоптоз с помощью проточной цитометрии с использованием набора для обнаружения апоптоза, содержащего аннексин V и йодид пропидия (PI) (маркеры апоптоза и некроза соответственно) через 4 ч инкубации в соответствии с инструкциями производителя><. заметка: Облучение Т-клеток Jurkat в УФ-сшивателе на энергетическом уровне 600 мкДж/^см2 после 4-часовой инкубации приведет к тому, что ≥75% апоптотических (как ранних, так и поздних) клеток будут иметь более ранний апоптотический фенотип, чем поздний апоптотический фенотип. Это облегчает альвеолярным макрофагам их распознавание и поглощение, поскольку их мембраны не скомпрометированы, в отличие от поздних апоптотических клеток, что приводит к более высокому эффероцитарному индексу и более точной визуализации эффероцитоза альвеолярных макрофагов в этом исследовании.
    1. Пул 333 мкл (1 x 10⁶ клеток) Т-клеток Jurkat из нескольких чашек (как «без ультрафиолетового излучения», так и «с воздействием ультрафиолетового излучения») для использования в пробирках для компенсационного анализа.
    2. Аликвота 333 мкл Т-клеток Jurkat в неокрашенных, одинарном окрашивании аннексина V, одинарном окрашивании PI, без контроля УФ-излучения, и 600 мкДж/^см2 меченых пробирках для проточной цитометрии с экспозицией УФ-излучения.
    3. Центрифужные пробирки при 188 х г в течение 5 мин при РТ и сцеживают надосадочную жидкость.
    4. Промойте клетки, повторно суспендируя в 500 мкл холодного, 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
    5. Центрифугируйте и гранулируйте ячейки при давлении 188 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования.
    6. Приготовьте 400 мкл 1x связующего буфера на проточную трубку, разбавив 10x связывающий буфер дистиллированной водой во время центрифугирования ячеек.
    7. Приготовьте инкубационный реагент аннексин V и PI (100 мкл на образец/пробирку) в соответствии с инструкциями производителя.
    8. После центрифугирования сцедите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте все пробирки в 400 мкл 1x связывающего буфера, затем добавьте 100 мкл инкубационного реагента аннексина V в каждую пробирку с образцом. Наконец, добавьте 100 мкл одиночного окрашивания аннексина V и одинарного окрашивания PI в соответствующие пробирки, но не добавляйте ничего, кроме 1x связывающего буфера в неокрашенную пробирку.
    9. Инкубируйте пробирки в темноте в течение 15 минут при RT.
    10. Центрифугируйте все ячейки при 188 x g в течение 5 мин при RT и сцеживайте надосадочную жидкость.
    11. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл 1x связывающего буфера, затем проанализируйте образцы на апоптоз с помощью проточной цитометрии. Соберите не менее 10 000 событий на каждую трубку, чтобы обеспечить точное представление окрашивания.
14. Соедините все облученные ячейки из чашек в коническую пробирку объемом 50 мл и грануляторы путем центрифугирования при 271 x g в течение 5 минут при RT.
15. Отобрать надосадочную жидкость из пробирки путем аспирации и ресуспендировать клетки в 24 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) и гранулированные клетки центрифугированием при 271 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
16. Отбраковать надосадочную жидкость из пробирки путем аспирации и ресуспендировать клетки в количестве PBS, используемом для дозирования мышам, одобренном IACUC. Используемая доза составляет 5-10 x 10⁶ клеток/50 мкл на мышь; поэтому для 10 мышей ресуспендировать в 500 мкл (количество клеток в каждой дозе варьируется в зависимости от того, сколько клеток культивируется для облучения).
    заметка: Примите не менее двух дополнительных доз, чтобы предотвратить прилипание жидкости к стенкам наконечника пипетки, что приведет к потере клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Комплект Annexin V-FITC	Тревиген	4830-250-К	Набор TACS Annexin V-FITC позволяет быстро, специфично и количественно идентифицировать апоптоз в отдельных клетках при использовании проточной цитометрии.
Т-клетки BCL2 Jurkat	АТКС	ATCC CRL-2899	Клеточная линия BCL2 Jurkat была получена путем трансфекции человеческих Jurkat T-клеток экспрессионным вектором млекопитающих pSFFV-neo, содержащим человеческую вставку BCL-2 ORF и ген, устойчивый к неомицину. Был для моделей измерения эффероцитоза.
Автоматизированный счетчик ячеек Countess II	Термофишер	AMQAX1000	Это настольная платформа для анализа, оснащенная современной оптикой, полным автофокусом и программным обеспечением для анализа изображений для быстрой оценки клеток в суспензии. Очень прост в использовании.
Цитоцентрифуга Cytospin 4	Термофишер	A78300003	Обеспечивает экономичные тонкослойные препараты из любой жидкой матрицы, особенно из гипоцеллюлярных жидкостей, таких как жидкость бронхоальвеолярного лаважа.
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, инактивированная при нагревании	Термофишер	16140071	Обеспечивает питательными веществами культивируемые клетки для их роста. Он является стандартным для клеточных культур.
Пенициллин-стрептомицин	Сигма/Олдрич	П0781-100МЛ	Пенициллин-стрептомицин является наиболее часто используемым раствором антибиотика для культивирования клеток млекопитающих. Кроме того, он используется для поддержания стерильных условий во время культивирования клеток.
RPMI 1640 Medium, добавка GlutaMAX	Термофишер	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) изначально был разработан для культивирования лейкозных клеток человека в суспензии и в виде монослоя. С тех пор среда RPMI 1640 была признана подходящей для различных клеток млекопитающих, включая HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, астроциты и карциномы. Помогает быстро и эффективно выращивать Т-клетки Jurkat.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	Кембриджский научный	16659 Номер 16659	УФ-сшиватель Stratalinker предназначен для индукции апоптоза, сшивки ДНК или РНК с нейлоновыми, нитроцеллюлозными или армированными нейлоном нитроцеллюлозными мембранами.

университет