$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка образцов
- Соберите периферическую кровь в гепаринизированные пробирки объемом 9 мл и поддерживайте образец при комнатной температуре (RT) в роторе до тех пор, пока это не потребуется для протокола эксперимента.
- Маркируйте пробирки цитометра объемом 5 мл для отрицательного контроля (2 пробирки), положительного контроля (2 пробирки) и различных концентраций аллергена/лекарства (по 1 пробирке на каждую исследуемую концентрацию аллергена/лекарства). Поместите пробирки в штатив, где пробирки идеально подходят друг к другу, не скользя.
- Приготовьте стимулирующий буфер в воде двойной дистилляции, содержащей 2% (v/v) HEPES, 78 мг/л NaCl, 3,7 мг/л KCl, 7,8 мг/л CaCl2, 3,3 мг/л MgCl2, 1 г/л HSA. Отрегулируйте pH до 7,4 и добавьте IL-3 в концентрации 2 нг/мл. Обычно готовят 100 мл и делят на 2,5 мл аликвот для заморозки при -20 °C.
- Подготовить положительный контроль в PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): положительный контроль 1, N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) (4 мкМ), для подтверждения качества базофилов; Положительный контроль 2, Anti-IgE (0,05 мг/мл) в качестве IgE-опосредованного положительного контроля.
- Приготовьте аллерген/лекарственное средство в PBS-T при концентрации><, в 2 раза превышающей желаемую конечную концентрацию.
заметка: Оптимальные концентрации аллергенов/лекарственных препаратов должны быть предварительно определены с использованием широкого диапазона концентраций, кривых "доза-реакция" и исследований цитотоксичности в соответствии с теми же этапами протокола.
2. Приготовление окрашивающей смеси
- Добавляйте моноклональные антитела, меченные флуорохромом, в буфер для стимуляции в соответствии с рекомендованной производителем концентрацией антител или путем предыдущего титрования антител. В этом протоколе мы добавляем по 1 мкл каждого антитела (CCR3-APC и CD203c-PE для идентификации базофилов; CD63-FITC для активации базофилов) на 20 мкл стимулирующего буфера.
заметка: Защищайте приготовленную смесь для окрашивания от света.
- Добавьте 23 мкл красящей смеси в каждую пробирку.
3. Стимуляция крови
- Добавьте 100 мкл PBS-T в пробирки 1 и 2 (отрицательный контроль), 100 мкл fMLP в пробирку 3, 100 мкл анти-IgE в пробирку 4 и 100 мкл различных концентраций аллергена/лекарственного средства в следующие пробирки. Выдерживать в течение 10 мин при 37 °C в термостатической ванне со средним перемешиванием до предварительного подогрева реагентов.
- Аккуратно добавьте по 100 мкл крови в каждую пробирку, чтобы избежать гемолиза. Аккуратно закрутите вихревые трубки и инкубируйте в течение 25 минут при 37 °C в термостатической ванне со средним перемешиванием.
- Остановите дегрануляцию, выдерживая температуру пробирок при температуре 4 °C не менее 5 мин.<бр/>
заметка: При необходимости протокол может быть приостановлен при температуре 4 °C на 30-45 минут.
4. Лизис эритроцитов
- Добавьте 2 мл 1x лизирующего буфера в каждую пробирку для лизиса эритроцитов. Сделайте вихревой насос в каждой пробирке и инкубируйте в течение 5 минут при RT.
заметка: На этом этапе клетки фиксируются за счет фиксирующих агентов (формальдегида), содержащихся в буфере.
- Центрифугируйте при 300 х г при 4 °C в течение 5 мин. Сцедите надосадочную жидкость, перевернув решетку в раковину. Клетки остаются на дне пробирок.
- Добавьте 3 мл PBS-T в каждую пробирку для промывания клеток. Закрутите каждую трубку.
- Центрифугировать при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин. Сцедить надосадочную жидкость, перевернув решетку в раковину.
заметка: Хранить образцы при температуре 4 °C в защищенном от света месте до получения проточного цитометра.
5. Получение данных проточной цитометрии
- Получение образцов с помощью проточного цитометра (например, BD FACSCalibur Flow Cytometer). Подключите проточный цитометр к компьютерному программному обеспечению и дождитесь готовности цитометра. Загрузите шаблон и настройки прибора (Таблица 1).
- Начните сбор образцов.
- Используйте следующие цитометрические стратегии для отбора активированных базофилов.
- Гейт лимфоцитов от графика Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
- Выведите базофилы из популяции лимфоцитов в виде CCR3+CD203c+ клеток. Приобретайте не менее 500 базофилов в каждой пробирке.
- Покажите график CCR3 - CD63 для анализа активации с использованием CD63 в качестве маркера активации. Установите отрицательный порог CD63 на уровне примерно 2,5% с помощью отрицательных контрольных трубок.
- Соберите все образцы.
Таблица 1: Требования к проточному цитометру
| Источники света (лазеры) | 488 нм Coherent SapphireTM аргон-ионный лазер с воздушным охлаждением; 20 мВт; 633 нм JDS UniphaseTM HeNe лазер с воздушным охлаждением; 17 мВт |
| Длина волны возбуждения света | Синий лазер: 488 нм; Красный лазер: 633 нм |
| Мощность источника света на возбуждающей длине волны | Синий лазер: 20 мВт; Красный лазер: 17 мВт |
| Оптические фильтры | ССК: 488/10; ФИТК: 530/30, ПЭ: 585/42, БТР: 660/20 |
| Оптические детекторы | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Оптические детекторы стяжек | Аргон-ионный лазер с воздушным охлаждением |
| Оптические тракты | октагон BD (лазерная линия 488 нм); BD Trigons (лазерная линия 633 нм) |