$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка игл для микроинъекций
- Подготовьте тонкостенные стеклянные капиллярные иглы для инъекций (1,0 OD/0,75 ID) с помощью устройства для вытягивания микропипеток со следующими настройками: давление воздуха 200, нагрев 502, вытягивание 90, скорость 80, время 70, время воздуха в начале вытягивания 5, воздушное время в конце вытягивания 5.
- С помощью тонкого пинцета отломайте кончик вытянутой иглы так, чтобы отверстие кончика имело диаметр примерно 10 мкм.
2. Приготовление блюд для инъекций личинок
- Промойте гелевую расческу шириной полосы примерно 4-5 мм в стерильной воде и дайте ей высохнуть.
- Приготовьте 1,5-2% раствор агарозы с высоким содержанием расплава в среде Е3 и разогрейте в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. После остывания высыпьте немного агарозы в чашку Петри (100 x 15 мм) и перемешайте, добавив ровно столько агарозы, чтобы полностью покрыть дно чашки.
- Как только слой агарозы застынет, положите сверху промытый и высушенный гелевый гребень так, чтобы негребенный конец просто лежал на верхней части чашки Петри, а гребенный конец касался агарозы. Следите за тем, чтобы гребень располагался максимально горизонтально, создавая угол 30° по отношению к нижнему слою агарозы.
- Насыпьте дополнительное небольшое количество агарозы на границе между гребнем и нижним агарозным слоем так, чтобы свежий слой агарозы покрывал лунки гребня. Дайте полностью остыть, прежде чем снимать расческу. С помощью наконечника пипетки удалите из лунок все нависающие кусочки агарозы.
- Налейте среду E3 на пресс-форму для литья под давлением и храните при температуре 4 °C.
- Перед каждым использованием заменяйте на свежую среду и теплые рампы для впрыска при температуре 28,5 °C в течение как минимум часа перед впрыском.
- Непосредственно перед инъекциями замените E3 на рампе для инъекций средой E3, содержащей 200 мкг/мл этил3-аминобензоата (трикаина).
3. Приготовление инокулята Streptococcus iniae (S. iniae)
- Приготовить и автоклав бульонную среду Тодда Хьюитта с добавлением 0,2% экстракта дрожжей и 2% протеозного пептона (THY+P): 30 г/л Тодда Хьюитта, 2 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л протеозного пептона. Для агаровых пластин добавьте 14 г/л агара.
- Приготовьте бактериальные культуры за ночь до инфекции, пипетируя 100 мкл аликвоты замороженного бактериального запаса в 10 мл бульона THY+P в герметичной пробирке объемом 15 мл. Инкубировать в течение ночи без перемешивания при 37 °C. После 14-16 часов роста используйте ночную культуру либо для создания запасов в морозильной камере, либо для подготовки к использованию в инъекциях.
- Сделайте запасы в морозильной камере, поместив 1 мл ночной культуры в 500 мкл 80% глицерина в центрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Чтобы избежать циклов замораживания-размораживания, сделайте из этой смеси 100 мкл одноразовых аликвот и храните их при температуре -80 °C.
- Для S. iniae, используемого при инфекциях, разведите ночную культуру в соотношении 1:100 до общего объема 10 мл культуры, добавив 0,1 мл ночной культуры к 9,9 мл бульона THY+P. Выращивайте при температуре 37 °C без перемешивания в течение примерно 4-5 часов. Контролируйте оптическую плотность (OD) на длине волны 600 нм с помощью спектрофотометра Nanodrop и собирайте бактерии в среднелогарифмической фазе, когда OD600 нм достигает 0,250-0,500. OD600 нм 0,250 соответствует примерно 108 колониеобразующим единицам (КОЕ)/мл.
- Гранулируйте 1 мл бактериальной культуры в центрифужную пробирку объемом 1,7 мл при давлении 1500 x g в течение 5 мин. Повторно суспендируйте в 1 мл свежего фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторите. Измерьте наружный диаметр 600 нм бактерий в PBS, гранулах и ресуспендии в PBS для достижения желаемой концентрации.
- Чтобы помочь в визуализации микроинъекций, добавьте феноловый красный в бактериальные суспензии перед инъекцией до конечной концентрации 0,1%.
- Для экспериментов, включающих инъекцию убитых теплом бактерий, нагревайте бактерии в PBS до 95 °C в течение 30 мин. Подтвердите, что процесс термического уничтожения снизил количество жизнеспособных бактерий до неопределяемого уровня, поместив объем инъекции (примерно 1 нл) на твердые агаровые планшеты THY+P и инкубируя в течение ночи при 37 °C.
4. Маркировка S. iniae с помощью красного флуоресцентного красителя CellTracker
- Чтобы пометить живые бактериальные клетки, приготовьте стоковый раствор флуоресцентного красителя CellTracker или его аналога. Поскольку используемый краситель поставляется в виде 20 x 50 μг аликвот порошка и должен быть ресуспендирован в диметилсульфоксиде (ДМСО), добавьте 7,3 μл ДМСО в пробирку для получения исходной концентрации 10 мМ.
- Протестируйте диапазон концентраций красителя (например, 0,5-25 мкМ) на бактериях, чтобы определить самую низкую оптимальную концентрацию, которая окрашивает клетки. Для быстро делящихся клеток и более длительных экспериментов может потребоваться более высокая концентрация красителя.
- Гранулируйте 1,0 мл бактериальной культуры в пробирку объемом 1,7 мл методом центрифугирования, как описано выше (раздел 3). Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл свежей PBS и добавьте соответствующий объем красителя к бактериальной культуре.
- Инкубировать без перемешивания при 37 °C в течение 30 мин. Раскрутить бактерии и повторно суспендировать в 1 мл предварительно подогретого бульона THY+P и инкубировать без перемешивания еще 30 мин при 37 °C.
- Уменьшите количество бактерий и промойте их два раза в PBS, прежде чем измерять OD600 нм и разбавлять бактерии для микроинъекций, как описано выше (раздел 3). Обычно мы вводим около 100 КОЕ в объеме 1 нл для наших исследований рекрутинга лейкоцитов и фагоцитоза.
5. Подготовка личинок данио-рерио к инфекциям
- Создайте племенные пары накануне вечером и соберите эмбрионы, как описано Розеном и др.Инкубируйте эмбрионы в среде Е3 при температуре 28,5 °C до готовности к заражению.
- Для рыбок данио, которые будут визуализированы, предотвратите развитие пигмента (меланизация) путем добавления N-фенилтиомочевины (PTU) в среду E3 через 24 часа после оплодотворения (hpf) для конечной концентрации 0,2 нМ.
- При инфекциях с участием эмбрионов в возрасте 2 дней после оплодотворения (dpf) дехорионат эмбрионов вручную с помощью тонкого пинцета. В качестве альтернативы можно дехорионировать эмбрионы, удалив Е3 и заменив их проназой (2 мг/мл) в течение примерно 5 минут или до тех пор, пока щадящее пипетирование не вырвет эмбрионы из хориона. Большинство личинок должны были вылупиться естественным путем через 3 dpf.
- Обезболите рыбок данио за несколько минут до заражения, поместив дехорионированных личинок в среду E3, содержащую 200 мкг/мл трикаина.
6. Инъекция глазных везикул S. iniae трехдневным личинкам
- Включите микроинъектор и установите временной диапазон на «миллисекунду». Откройте клапан на баке с углекислым газом, чтобы пропустить газ в линию. Давление микроинъектора должно составлять примерно 20 фунтов на квадратный дюйм (PSI). Отрегулируйте давление в блоке микроинжектора, поворачивая черную ручку с накаткой по часовой стрелке для увеличения давления или против часовой стрелки для снижения давления.
- Приготовленную культуру S. iniae окунают в фенольный красный и PBS и с помощью наконечника микрозагрузчика загружают 2-3 мкл культуры в вытянутую капиллярную иглу для инъекций.
- Установите заряженную иглу на микроманипулятор, подключенный к магнитной стойке, и расположите ее под стереомикроскопом так, чтобы игла находилась примерно под углом 45-65° по отношению к основанию микроскопа.
- Нажмите на ножную педаль микроинъектора, чтобы капнуть каплю инокулюма на кончик иглы. Измерьте диаметр капли с помощью масштабной линейки в окулярной линзе микроскопа.
- В качестве альтернативы можно оценить диаметр капли, введя объем в каплю минерального масла на предметном стекле для стеклянного микроскопа с помощью шкалы. Диаметр капли должен составлять примерно 0,10 мм, что составляет примерно 1 nl объема.
- Отрегулируйте размер капли, отрегулировав настройку длительности на микроинъекторе или отрезав большую часть кончика иглы тонким пинцетом. Обратите внимание, что время инъекции должно составлять от 20 до 35 мс, чтобы избежать слишком сильного повреждения тканей.
- С помощью пластиковой передаточной пипетки перенесите 12 личинок под наркозом в каждую лунку формы для литья под давлением.
- Используйте стеклянный стержень, петлю для волос или пластиковый наконечник, чтобы аккуратно расположить личинки так, чтобы головки были направлены к задней части микроскопа, а желточные мешки находились напротив левой стороны лунки. Направьте левое ухо личинки вверх к потолку.
- Глядя через окулярную линзу стереомикроскопа, с помощью ручек на микроманипуляторе выровняйте нагруженную иглу с глазным пузырьком так, чтобы обе находились в одном поле зрения. Проткните наружный эпителиальный слой глазного пузырька кончиком иглы так, чтобы кончик иглы оказался как раз внутри пузырька.
- Нажмите на ножную педаль, чтобы ввести 1 нл желаемой дозы S. iniae. Обязательно нужно использовать достаточно низкое давление, чтобы не разорвать полость. Если инъекция прошла успешно, глазной пузырь, но не окружающие ткани, должен быть заполнен феноловым красным инокулюмом (рисунок 1 Ai). Немедленно удалите любую неправильно введенную рыбу с инъекционной пластины.
- Осторожно выведите иглу из личинки и переместите инъекционную пластину рукой так, чтобы следующая личинка оказалась в поле зрения. Делайте это при 5-кратном увеличении.
заметка: Ретракция иглы может привести к отложению некоторых бактерий за пределами глазного пузырька, что может исказить результаты выживаемости и рекрутирования лейкоцитов. Чтобы избежать этого, рекомендуется вводить бактерии, меченные флуоресцентными красителями, и визуально сканировать введенных личинок под флуоресцентным микроскопом, чтобы удалить любые личинки, где это произошло. Правильно введенная личинка показана на рисунке (Рисунок 1 Bi).
- Чтобы убедиться, что объем инъекции/инокулюма остается неизменным в течение эксперимента, введите каплю бактериальной суспензии в центрифужную пробирку объемом 1,7 мл, содержащую 100 мкл стерильного PBS, после каждого48-го эмбриона. Нанесите 100 мкл на агаровые пластины THY+P при температуре 37 °C на ночь, чтобы определить КОЕ в объеме впрыскиваемого топлива.
- Когда вся группа из 12 личинок на инъекционной рампе будет введена внутрь, осторожно с помощью пластиковой передаточной пипетки удалите личинки из лунок и поместите их в новую чашку Петри (35 x 10мм2). Удалите раствор трикаина и замените его примерно 2 мл свежей среды Е3, чтобы дать личинкам возможность восстановиться.
- Пипетка вводила личинки в одиночные лунки 96-луночного планшета и инкубировала при 28,5 °C. Отслеживайте личинок с течением времени на предмет выживания в этих планшетах или удаляйте их позже для визуализации или подсчета КОЕ.
7. Фиксация личинок для визуализации
- Закрепите личинки в ледяном 4% параформальдегиде в растворе PBS, как описано в разделе 7.
- При комнатной температуре умыться 3 раза по 5 минут каждый в PBS перед нанесением изображения.
8. Подготовка личинок к визуализации в реальном времени
- Приготовьте 1,5% раствор агарозы с низкой температурой плавления в E3, нагревая его в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
- Поместите раствор агарозы на водяную баню с температурой 55 °C, чтобы он остыл, но не застыл.
- Добавьте трикаин в агарозу до конечной концентрации 0,016%.
- С помощью пластиковой переводной пипетки поместите 4-5 личинок под наркозом в стеклянную донную посуду на предметном столике стереомикроскопа.
- Снимите раствор трикаина и агарозы с водяной бани при температуре 55 °C и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 1-2 минут. Пока агароза остывает, удалите как можно больше жидкости из обезболенных личинок.
- Вылейте остывшую агарозу в посуду до тех пор, пока поверхность не будет покрыта примерно наполовину. Поворачивайте блюдо, чтобы выложить агарозу. Учтите, что если агароза будет слишком горячей, она убьет личинок. Кроме того, если в чашку добавлено слишком много агарозы, объектив микроскопа может удариться о дно чашки при фокусировке через агарозу.
- С помощью переводной пипетки подхватите личинок, которые плавали по бокам чашки, и направьте их пипеткой обратно в центр.
- Аккуратно расположите личинки под стереомикроскопом с помощью петли для волос, длинного кончика пипетки или стеклянного стержня. Для визуализации глазного пузырька расположите личинки так, чтобы левый глазной пузырь был плоско прилегать ко дну посуды.
- Дайте агарозе остыть около 10 минут, прежде чем перемещать блюдо. Личинки могут менять положение, если агароза не твердая. Аккуратно нанесите немного раствора трикаина и Е3 на верхнюю часть слоя агарозы, чтобы он оставался влажным.
9. Конфокальная визуализация инфекции
- Поместите стеклянную донную чашку с личинками на предметный столик инвертированного микроскопа с лазерной сканирующей конфокальной системой FV-1000.
- Установите отверстие на 200-300 μм и с помощью объектива с числовой апертурой 0,75/20X установите z-стеки с ломтиками 3-6 μм.
- Используйте непрерывное сканирование линий для регулировки мощности лазера и усиления детектора для каждого канала.
- Используя последовательное линейное сканирование для каждого флуоресцентного канала (например, 488 и 543 нм) и дифференциальный интерференционный контраст (DIC), проводите покадровую съемку левого глазного пузырька каждые 3 минуты в течение 2-6 часов, чтобы наблюдать за начальным набором и фагоцитозом нейтрофилов и макрофагов. Для более длительных курсов накройте чашку Петри крышкой, чтобы предотвратить испарение и высыхание агарозы.
- Получение неподвижных (Рисунок 1B) или живых (Рисунок 2) личинок с 20-кратным или 40-кратным увеличением.
10. Фотоконверсия меченых Dendra2 лейкоцитов в отической везикуле
ПРИМЕЧАНИЕ: Dendra2 можно фотопреобразовать из зеленой в красную флуоресценцию, сфокусировав лазер с длиной волны 405 нм (50-70% мощности лазера должно быть достаточно) на области интереса (ROI) в течение 1 мин. Ниже приведен пошаговый протокол, используемый для лазерной сканирующей конфокальной системы FV-1000:
- Визуализируйте образец с помощью сканирования z-стека с лазерами 488 нм и 543 нм. Используйте непрерывное линейное сканирование для регулировки мощности лазера и усиления детектора. Убедитесь, что нет случайно фотопреобразованной красной флуоресценции.
- В окне "Управление получением изображений" в разделе "Настройка стимула" выберите инструмент "Использовать сканер" и выберите "Основной". Выберите лазер с длиной волны 405 нм и установите его на 70% мощности. Используя опцию круга, определите ROI в отическом пузырьке.
- В разделе "Настройка запуска стимула" выберите "Последовательная активация" с предварительной активацией 1 кадра и временем активации 60 000 мс. В окне "Настройка захвата" под заголовком "Сканирование времени" выберите 2 интервала 00:01:00 (один для до- и один для постфотопреобразования).
заметка: После завершения серийного сканирования Dendra2 должен был быть фотопреобразован в красное флуоресцентное состояние.
- Отсканируйте образец с помощью z-стека с использованием лазеров с длиной волны 488 нм и 543 нм, чтобы визуализировать фотопреобразованную красную флуоресценцию, а также любую оставшуюся зеленую флуоресценцию (рис. 3).
