Трехмерная количественная фазовая визуализация для характеристики подтипов лимфоцитов

Аннотация

Источник: Yoon, J. et al. Безмаркерная идентификация подтипов лимфоцитов с использованием трехмерной количественной фазовой визуализации и машинного обучения. J. vis. Exp.(2018)

Это видео демонстрирует безметочную идентификацию морфологии и биохимии лимфоцитов с помощью 3D-количественной фазовой визуализации. Этот метод позволяет провести тщательный анализ лимфоцитов, выявить их внутренние структуры и свойства без необходимости проведения процедур маркировки.

Протокол

1. Проточная цитометрия и сортировка подтипов лимфоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Сортировка лимфоцитов в зависимости от типа клеток необходима для установления достоверных (т.е. правильных) меток типов клеток для обучения и тестирования классификатора типов клеток в контролируемом обучении. Проточная цитометрия, метод золотого стандарта, используется для идентификации и разделения лимфоцитов.

1. Приготовьте смесь антител, окрашивающих поверхностные маркеры, в 100 мкл свежей среды RPMI-1640 [с 10% FBS, 0,1 мкг CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) и NK1.1 (PK136)] и 0,25 мкг антител CD4 (GK1.5) для мишеней B, CD4⁺ T и CD8⁺ T.
2. Добавьте 100 мкл смеси антител в клеточную суспензию.
3. Выдерживать 25 минут на льду.
4. Промойте ячейки, добавив 5 мл PBS и центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C, дважды.
5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл свежей среды RPMI-1640 с 10% FBS и 2,5 мкг DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол).
6. Соберите каждый тип лимфоцитов отдельно с помощью проточной цитометрии с использованием уровней флуоресценции маркеров, описанных выше. Одновременно исключите мертвые клетки с помощью сигналов DAPI.

2. 3D Количественная фазовая визуализация

1. Держите отсортированные лимфоциты на льду во время процедур визуализации, которые должны быть завершены в течение 5 ч (с момента выделения лимфоцитов от мыши), чтобы избежать повреждения клеток и биохимических изменений.
2. Выберите тип отсортированных клеток (среди B, CD4⁺ Т и CD8⁺ Т-лимфоцитов) и разбавьте образец до 180 клеток/мкл средой RPMI для оптимальных условий визуализации (т. е. одна клетка на одно поле зрения).
3. Загрузите 120 мкл разбавленного образца в камеру для визуализации путем медленного впрыска. Тщательно проверьте наличие пузырьков в камере визуализации с образцом. Если есть пузырьки, аккуратно удалите их, так как они поставят под угрозу качество измерений.
4. Получение 3D томограмм RI с помощью коммерческого 3D количественного фазового микроскопа или голотомографии и его программного обеспечения для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об экспериментальной установке можно найти в оригинальной рукописи.
   1. Капните каплю дистиллированной воды на верхнюю часть линзы объектива микроскопа.
   2. Поместите камеру с образцом на ступень для трансляции микроскопа и отрегулируйте ее положение так, чтобы образец совпал с линзой объектива.
   3. Отрегулируйте осевое положение объектива и конденсорных линз, нажав «Фокус» и «Поверхность» соответственно на вкладке «Калибровка» перспективы «Микроскоп» программного обеспечения для обработки изображений.
   4. Совместите объектив и линзы конденсора, нажав «Автоматический режим». В качестве альтернативы используйте режим сканирования и вручную отрегулируйте линзы так, чтобы диаграммы освещенности были локализованы в центральной области поля зрения.
   5. Вернитесь в обычный режим и настройте этап трансляции так, чтобы ячейка находилась в поле зрения.
   6. Найдите фокальную плоскость, отрегулировав осевое положение линзы объектива. Идеальная фокусировка делает визуализируемую на экране границу образца практически незаметной.
   7. Настройте этап перевода, чтобы найти местоположение без ячейки.
   8. Нажмите «Калибровать», чтобы измерить несколько 2D-голограмм с различными углами освещения.
   9. Настройте этап перевода так, чтобы ячейка находилась в центре поля зрения.
   10. Перейдите на вкладку "Получение" и нажмите кнопку "3D Snapshot", чтобы измерить голограммы ячейки с одинаковыми углами освещения, как это было сделано на шаге 2.4.8.
   11. Когда полученные данные будут представлены на панели «Управление данными», щелкните правой кнопкой мыши по полученным данным и выберите «Обработать» для реконструкции томограммы 3D RI по голограммам, измеренным на шагах 2.4.8 и 2.4.10, с использованием алгоритма дифракционной томографии, реализованного в программном обеспечении для визуализации.
   12. Повторите шаги 2.4.5-2.4.11 для измерения более 100 ячеек, чтобы обеспечить статистическую мощность машинного обучения.
   13. Все изображения, которые обрабатываются на шаге 2.4.11, могут быть визуализированы. На панели "Управление данными" щелкните правой кнопкой мыши данные и выберите "Открыть", чтобы визуализировать данные. Нажмите RI Tomogram на панели "Data Manager". На вкладке «Предустановка» нажмите «Загрузить» и дважды щелкните «lymphocyte.xml», которая является предопределенной функцией передачи, предоставляемой программным обеспечением для визуализации томограммы в соответствии с распределениями 3D RI.
5. Повторите шаги 2.2-2.4 для измерения 3D томограмм RI всех подтипов лимфоцитов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Проточная цитометрия	BD Biosciences	Ария II или III
Камера визуализации	Томокуб, Инк.	ТомоДишн
Голотомография	Томокуб, Инк	ХТ-1Н
Программное обеспечение для голотомографической визуализации	Томокуб, Инк.	ТомоСтудия
Программное обеспечение для обработки изображений	Математические работы	Матлаб R2017b
Коническая центрифужная трубка Falcon	ThermoFisher Scientific	14-959-53А	15 мл
Фосфатно-солевой буфер	Сигма-Олдрич	806544-500МЛ
Аммоний-хлоридно-калийный лизирующий буфер	ThermoFisher Scientific	A1049201
RPMI-1640 средний	Сигма-Олдрич	Р8758
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher Scientific	10438018