Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB
1. Забор крови у пациентов
ВНИМАНИЕ: Примите соответствующие меры лабораторной безопасности при сборе цельной крови пациента. Наденьте перчатки и очки. Если пациент находится в изоляции, соблюдайте процедуры 4-го уровня биобезопасности.
- Для внутривенного забора цельной крови пациента используйте иглу-бабочку с удлинительной трубкой малого диаметра и вакуумную трубку для сбора крови, содержащую буфер для лизиса/связывания. Положите руку пациента в положение вниз и расположите трубку для сбора ниже иглы-бабочки. Вставьте иглу-бабочку в вену пациента и прикрепите вакуумную трубку для забора крови к удлинителю малого диаметра.
заметка: Это предотвратит обратный поток.
- После забора крови перемешайте содержимое пробирки, перевернув пробирку 5 - 10 раз.<бр/>
заметка: Из-за оставшегося вакуума в пробирке для сбора крови, содержащей 1,6 мл буфера для лизиса/связывания, объем собранного образца автоматически составит 1,6 мл.
- Продезинфицируйте внешнюю сторону пробирки с помощью 70% этанола.
- Инкубируйте пробирки в течение 20 минут при комнатной температуре.
заметка: Здесь протокол можно приостановить, а полные пробирки для сбора крови можно хранить при температуре -20 °C, 5 °C, 25 °C или 37 °C в течение как минимум 1 месяца.
- Перейдите непосредственно к упрощенному методу извлечения NA.
2. Упрощенное извлечение NA из цельной крови
- Чтобы очистить NA от собранной крови, инактивированной лизисом/связывающим буфером, перемешайте содержимое пробирки, перевернув вакуумную пробирку вручную 5 - 10 раз.
- Осторожно снимите крышку с трубки и снимите крышку.
- Высыпайте подготовленную аликвоту MGP (1 мл) непосредственно в пробирку для сбора крови.
- Наденьте новую крышку от неиспользованной пробирки для сбора крови на пробирку с образцом.
- Положите палец на крышку, чтобы убедиться, что пробирка плотно закрыта, и перемешайте содержимое пробирки, перевернув пробирку для сбора крови рукой 5 - 10 раз.
- Поместите трубку в магнитный держатель и держите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта.
- Переверните магнитный держатель с трубкой несколько раз вручную, чтобы убедиться, что все MGP собраны на боковой стороне трубки с магнитом.
заметка: Магнитный держатель может быть заменен на удлиненный магнит и резинку.
- Снимите крышку пробирки и выбросьте содержимое пробирки либо с помощью одноразовой пипетки, либо просто высыпав содержимое в пробирку для сбора объемом 50 мл.
заметка: Избегайте попадания аэрозолей из пробирки объемом 50 мл, закрыв пробирку крышкой.
- Подготовленную аликвоту промывочного буфера-1 (WB-1, 4 мл) насыпьте непосредственно в пробирку для сбора крови.
- Накройте трубку крышкой и положите палец на крышку, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта.
- Извлеките трубку из магнитного держателя, надежно затянув крышку пальцем.
заметка: Если вы используете магнит и резинку, просто снимите резинку и магнит с трубки.
- Восстановите суспендию MGP, перевернув пробирку для сбора крови вручную 5–10 раз.
- Повторите шаги 2.6 - 2.8.
- Залейте подготовленную аликвоту WB-2 (1,5 мл) непосредственно в пробирку для сбора крови.
- Наденьте крышку на трубку и извлеките трубку из магнитного держателя.
заметка: Если вы используете магнит и резинку, просто снимите резинку и магнит с трубки.
- Положите палец на крышку, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта.
- Подвешивайте MGP, перевернув пробирку для сбора крови вручную на несколько секунд.
- Повторите шаги 2.6 - 2.8.
- Залейте подготовленную аликвоту WB-3 (3 мл) непосредственно в пробирку для сбора крови.
- Наденьте крышку на трубку и извлеките трубку из магнитного держателя.
заметка: Если вы используете магнит и резинку, просто снимите резинку и магнит с трубки.
- Положите палец на крышку, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта.
- Восстановите суспендию MGP, перевернув пробирку для сбора крови вручную 5–10 раз.
- Повторите шаги 2.6 - 2.8.
- Вылейте приготовленную аликвоту элюирующего буфера (EB, 100 μл) непосредственно в пробирку для сбора крови.
- Наденьте крышку на трубку и извлеките трубку из магнитного держателя.
заметка: Если вы используете магнит и резинку, просто снимите резинку и магнит с трубки.
- Ресуспендирование MGP в ЭБ путем постукивания пальцем по пробирке для сбора крови 5 - 10 раз.
заметка: Здесь протокол можно приостановить, а пробирки хранить при температуре -20 °C.
- Перенесите одну каплю (5 - 8 мкл) ресуспендированных MGP в последующую реакционную смесь амплификации NA с помощью одноразовой пипетки объемом 1,5 мл (можно использовать любой последующий диагностический анализ амплификации NA, такой как петлевая изотермическая амплификация (LAMP) / лампа обратной транскрипции (RT-LAMP) или количественная полимеразная цепная реакция (qPCR)/RT-qPCR).
заметка: NA будут прилипать к MGP, поэтому обязательно используйте MGP в реакции амплификации NA ниже по потоку. Перед применением смешайте суспензию MGP. После смешивания MGP будут собираться на дне пробирки.
