$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Получение липосом
- Рассчитайте количество хлороформ-суспензионных исходных растворов 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДОПК) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-кап биотинила (Биотин-ПЭ) для получения разбавленных запасов в нужной конечной концентрации. Чтобы получить конечные концентрации 400 мкМ DOPC и 80 мкМ фосфолипидов Biotin-PE по 10 мл каждая, начните с помещения 629 мкл 10 мг/мл DOPC и 88 мкл 10 мг/мл Biotin-PE в отдельные стеклянные хроматографические пробирки><.
ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянные шприцы Hamilton и стеклянные хроматографические трубки важно очищать очистным раствором (1 л 95% этанола на 120 мл воды, содержащей 60 г гидроксида калия, KOH) при переносе взвешенного хлороформа исходного раствора DOPC и Biotin-PE.
- Высушите хлороформ струей аргона в химическом колпаке. Заклейте хроматографическую трубку парапленкой.
- Подвергните только что высушенные липосомы воздействию высокого вакуума в лиофилизаторе на ночь (O/N) для удаления остатков хлороформа. Для завершения в тот же день высушите в течение 60-90 минут.
- Пока лиофилизатор работает, приготовьте буфер для разведения. Для этого протокола приготовьте 25 мл, состоящие из 25 мМ Трис, pH 8,0; 150 мМ NaCl; и 2% (по весу) n-октил-β-D-глюкопиранозида (ОГ) моющего средства. Сначала смешайте первые два ингредиента, затем вытесните кислород аргоном, прежде чем добавлять сухой порошок OG. После приготовления отфильтруйте раствор OG с мембраной из ацетата целлюлозы 0,2 микрона и храните при температуре 4°C.
- Кроме того, приготовьте две бутылки с завинчивающейся крышкой по 1 л трис-солевого буфера в тех же концентрациях, но без ОГ. Поместите на дно каждого из них дистиллированную магнитную мешалку. Приготовьте дополнительно 6 литров трис-солевого буфера. Удалите кислород из всех флаконов с аргоном и также поставьте их при температуре 4° C.
- После лиофилизации растворите высушенные липиды в трис-физиологическом буфере OG, чтобы получить 4 мМ раствор каждого. Следуя примеру объемов, добавьте 2 мл в пробирку ДОПК, и 0,2 мл в пробирку Биотин-ПЭ.
- Смешайте липиды биотина-ПЭ с липидами DOPC. Это улучшает подвижность SLB, так как связанный биотин может ухудшить текучесть фосфатных головных групп. Чтобы получить конечную концентрацию 80 мкМ Биотин-ПЭ, смешайте 0,2 мл 4 мМ Биотин-ПЭ и 1 мл 4 мМ ДОПК. Затем добавьте 8,8 мл трис-солевого буфера OG.
- Для получения окончательной концентрации 400 мкМ DOPC просто смешайте 1 мл 4 мМ DOPC с 9 мл трис-физиологического OG.
- Наполните ультразвуковой аппарат ледяной водой. Поместите стеклянную трубку, содержащую разведенный фосфолипид, в центр ультразвукового аппарата с помощью хомута. Ультразвуком обработайте разведенный фосфолипид в течение 10 минут, пока раствор не станет прозрачным.
заметка: Добавьте лед в водяную баню ультразвукового аппарата, чтобы поддерживать низкую температуру, так как ультразвуковая обработка будет выделять тепло.
- Заполните трубки аргоном, чтобы вытеснить кислород в воздухе жидкостью, и заклейте их парапленкой.
2. Диализ липосом
- Отрежьте от рулона два отрезка трубки для сухого диализа (отсечка по молекулярной массе: 12-14 000, диаметр: 6,4 мм) соответствующей длины (в данном примере 40 см), по одному на каждое разведение фосфолипидов.
- Увлажните секции трубок, дав им замочиться в 200 мл дистиллированной воды в стеклянной стакане на 2 минуты.
- Разогрейте в микроволновой печи в течение 5 минут при высокой температуре или, по крайней мере, пока вода не закипит.
- Завяжите узел на одном конце каждой трубки и промойте внутреннюю часть несколькими миллилитрами буфера Tris-saline-OG. После этого тщательно выжмите как можно больше этого буфера для промывки, чтобы свести к минимуму количество буфера, оставшегося внутри.
- В колпак с ламинарным потоком добавьте разведенные фосфолипиды в каждую трубку и зажмите открытые концы небольшой крышкой диализной трубки так, чтобы исключить весь воздух. Полное удаление воздуха потребует принесения в жертву небольшого объема пробы путем зажима ниже «ватерлинии».
- Погрузите образцы в подготовленные ранее флаконы с Трис-солевым буфером без ОГ. Вытесните кислород в бутылке аргоном перед повторной укупоркой и перемешайте O/N при 4°C.
- Перекладывайте трубку в новую бутылку с Трис-солевым буфером без ОГ каждые 12 ч не менее 3 раз.
- Незадолго до удаления диализованных липидов подготовьте ряд небольших пробирок, в которые можно записать липиды, заполнив каждую аргоном для вытеснения кислорода.
- Через 36 часов поместите диализные флаконы в колпак с ламинарным потоком и извлеките диализные трубки из бутылок. Имейте под рукой скамейку, подгузник или стакан, чтобы собирать влажные стоки.
- Разрежьте диализную трубку над зажимом, затем снимите зажим и осторожно переведите диализованный липидный раствор через пипетку в 1 мл аликвоты в заранее подготовленные пробирки, заполненные газообразным аргоном, на льду.
- Добавьте водный раствор липосомы и используйте струю аргона, чтобы снова вытеснить кислород в каждой трубке.
- Храните липосомы при температуре 4°C. Не замораживайте.
3. Выделение и культивирование NK-клеток человека
- Аликвоту 15 мл периферической крови или охристой шерсти в коническую пробирку объемом 50 мл. Разбавьте эту кровь фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в соотношении 1:1.
- Аккуратно добавьте 13 мл Ficoll на дно пробирки с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
- Центрифугируйте эту пробирку в течение 20 минут при давлении 1 200 x g с ускорителем и отломом или при их минимальных настройках.
- После центрифугирования используйте серологическую пипетку для сбора плавающего мутного белого среднего слоя мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), который должен находиться на пересечении между прозрачным желтым верхним слоем и более мутным бледным нижним слоем, оба из которых находятся над самым нижним слоем эритроцитов (эритроцитов). ПРИМЕЧАНИЕ: Не собирайте RBC при сборе PBMC.
- Поместите собранные PBMC в новую коническую пробирку объемом 50 мл и разбавьте до емкости PBS, содержащей 1% FBS. Снова центрифуга, на этот раз с максимальным тормозом и акселератором, в течение 5 минут при 300 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл PBS, содержащего 1% FBS.
- Подсчитайте ячейки во время центрифугирования еще раз при тех же настройках, что и в шаге 3.6.
- Отбросьте надосадочную жидкость еще раз и ресуспендируйте клетки в среде R10 с плотностью 10 миллионов клеток/мл.
- Возьмите 30 миллионов клеток в полистирольную пробирку объемом 5 мл и выделите NK-клетки с помощью набора для магнитной сепарации, следуя инструкциям производителя. После выделения подсчитайте еще одну клетку и ресуспендируйте при плотности 500 000 клеток/мл в полной среде R10 (88% среды Мемориального института Розуэлл Парк, RPMI; 10% FBS; 1% N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этана сульфоновой кислоты, HEPES; 1% пирувата натрия) с добавлением IL-2 (100 Ед/мл). Культивируйте при температуре 37° в инкубаторе сСО2 и заменяйте среду 2-3 раза еженедельно.
4. Сборка планарного липидного бислоя со стеклянной опорой
- Приготовьте 100 мл раствора пираньи, смешав 30% перекись водорода с серной кислотой в соотношении 1:3 в стакане.<бр/>
заметка: Всегда проводите работу с вредными веществами, такими как серная кислота, в правильно предназначенном для этого вытяжном шкафу для химикатов.
- В этот раствор погрузите 2 прямоугольных покровных стекла #1.5 в раствор пираньи на 20-30 мин.<чел/>
заметка: Необходимо очистить покровные стекла раствором пираньи.
- Во время чистки покровных стекол возьмите 1 тюбик предварительно приготовленных липидов 400 мкМ DOPC и 1 тюбик предварительно приготовленных 80 мкМ липидов Biotin-PE. Транспортируйте их на льду в аргоновый бак.
- Вытесните кислород в новой микроцентрифужной пробирке аргоном, затем добавьте DOPC и Biotin-PE в соотношении 1:1. Конкретный объем будет варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей, но должен составлять не менее 2 мкл каждого. Вытесните кислород в пробирке со смесью еще раз с помощью газообразного аргона, а также из отдельных пробирок с реагентами, прежде чем вернуть последний в холодильник.
- После того, как они закончат чистку, тщательно промойте покровные стекла дистиллированной водой. Выньте покровные стекла для сушки на воздухе в течение нескольких минут.
- Извлеките 1,5 мкл смеси липосом, приготовленной на шаге 5.4, и добавьте ее одной каплей в одну из камер полосы предметного стекла камеры. Использование 2 капель на дорожку типично, но не обязательно.
- Быстро и качественно наложите сухой покровный лист на капли. Убедитесь, что капли расположены на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы они не слились после установки покровного стекла. Кроме того, следите за тем, чтобы капли оставались круглыми и четко очерченными, не касаясь краев стенок камеры. Плотно прижмите друг к другу между каждой полосой движения и вокруг нее, чтобы обеспечить водонепроницаемое уплотнение между покровным стеклом и салазкой.
- Отметьте положение капель маркером.
- Пропустите 100 μл водного 5% казеина через камеру, чтобы заблокировать бислой. Постарайтесь убедиться в отсутствии пузырьков в проточной камере.
- Введите по 100 мкл стрептавидина в концентрации 333 нг/мл в каждую дорожку. Инкубировать в течение 10-15 минут при комнатной температуре (RT). После этого промойте 3 мл HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS)/1% сывороточного альбумина человека (HSA) через каждую дорожку, чтобы удалить избыток стрептавидина.
- Добавьте 100 мкл биотинилированного флуоресцентно меченного анти-CD16, такого как Alexa Fluor 568, в концентрации белка, ранее определенной как наиболее эффективная. Выдерживать в темноте 20-30 минут. Промойте еще раз, пропустив 3 мл HBS/1% HSA через каждую дорожку.
- Пропустите 100 мкл D-биотина в концентрации 25 нМ через камеру, чтобы связать любой избыток стрептавидина и, таким образом, исключить вероятность неспецифического связывания стрептавидина с клетками.
- Подсчитывают NK-клетки и ресуспендируют в концентрации 500 000/мл в HBS/1% HSA.
- Во время вращения клеток вымывайте D-биотин из камеры еще 3 мл HBS/1% HSA на каждую дорожку.
- Проверьте подвижность лигандов на SLB с помощью восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, FRAP) на флуоресценции полного внутреннего отражения (TIRF) или конфокальной микроскопии перед добавлением NK-клеток.
- После того, как клетки закончат вращение и будут повторно суспендированы в желаемой концентрации, добавьте по 100 мкл в каждую дорожку.
- Поместите камеру в инкубатор с температурой 37° 5% CO2 на 30-60 минут.
- После этого инкубационного периода зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в RT на 10-20 мин. Промойте, пропустив 3 мл PBS через каждую дорожку для удаления параформальдегида.
- Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (5% обычной сыворотки ослика и 0,2% Triton X-100 в PBS). Инкубировать при RT в течение 30 минут.
- Окрашивание F-актина и перфорина путем добавления 200 мкл разбавленного флуоресцентно меченного фаллоидина (1 ед/мл меченого фаллоидина) и флуоресцентно меченного антиперфоринового моноклонального антитела (500 нг/мл антиперфорина mAb). Инкубировать при RT в течение 1 часа.
- Умыться, запустив 3 мл PBS. Камера готова к визуализации.
5. Визуализация NK-синапса на липидном бислое с помощью STED
- Включите все необходимые аппаратные модули.
- Запустите программное обеспечение для анализа изображений. Включите как резонансное сканирование, так и модули STED. После того, как вы сделаете эти выборы, подождите около 3-5 минут, пока программное обеспечение не запустится.
- Нажмите на вкладку «Конфигурация» в верхней части экрана.
- Выберите «Конфигурация лазера», затем включите белый свет и лазеры STED 592 нм.
- Выберите объектив 100x и совместите луч возбуждающего лазера с лазером с обеднением 592 нм.
- Выберите модуль "Laser Config", выключите лазер на истощение 592 и включите лазер на истощение 660 нм.
- Поместите слайд на сцену, поверх объектива. Сфокусируйте клетки, связанные на отграниченной области бислоя, с помощью лампы белого света и окуляров.
- Вернитесь на вкладку "Приобретение", непосредственно справа от вкладки "Конфигурация".
- Перейдите на вкладку "Переключиться на белый свет", затем включите этот модуль и перетащите линию возбуждающего лазера на соответствующую длину волны.
- Выберите нужный детектор из списка доступных, затем установите диапазон обнаружения, охватывающий соответствующий диапазон длин волн.
заметка: НИКОГДА не помещайте дальность обнаружения непосредственно под луч возбуждения.
- Нажмите на кнопку «Последовательный» на левой панели инструментов «Получить», чтобы открыть диалоговое окно «Последовательное сканирование» в нижней части левой панели инструментов. Это позволяет пользователю добавлять несколько последовательностей, каждая из которых имеет свой возбуждающий луч для своего цвета. Нажмите «Между кадрами», а затем установите частоту возбуждения, детектор и дальность обнаружения для каждого дополнительного цвета, как в шагах 5.9 и 5.10.
- После того, как все настройки будут оптимизированы, нажмите «Старт», чтобы начать процесс приобретения.