1. Подготовка контрольных элементов
- Переложите следующие пробирки по 1,5 мл с соответствующей маркировкой:
- Добавьте 500 мкл свежего IMDM, содержащего ресуспендированные клетки K562, меченные DiO, в пробирку объемом 1,5 мл с двойной положительной меткой.
- Добавьте 500 мкл свежего IMDM, содержащего ресуспендированные клетки K562, меченные DiO, в пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой «DiO».
- Добавьте 500 мкл свежих IMDM, содержащих ресуспендированные немеченые клетки K562, в пробирку объемом 1,5 мл с меткой «Только йодид пропидиума (PI)».
- Поместите пробирки Double Positive и PI-only в водяную баню при температуре 55 °C на 5 минут.
- По истечении 5 минут извлеките трубки и протрите их 70% этанолом.
- Добавьте 10 л PI в пробирки Double Positive и PI только 1,5 мл.
- Поместите все три целевых элемента управления K562 в инкубатор при температуре 37 °C на 30 минут.
- По истечении 30-минутной инкубации центрифугируйте все три контрольные клетки-мишени K562 в течение 2 мин при 163 x g.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу.
- Повторно суспендируйте каждый элемент управления 20 мкл свежей среды для культивирования клеток IMDM и оставьте в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 не менее чем на 30 минут для получения оптимального сигнала DiO><.
заметка: Теперь элементы управления готовы к прогону через проточный цитометр визуализации.
2. Подготовка образца для анализа цитотоксичности
- Подготовьте и промаркируйте пробирки объемом 1,5 мл для каждого образца/участника соответственно.
- Пипетка требовала соотношения NK-клеток и меченых DiO клеток K562 в каждой пробирке.
Примечание: Например, желаемое соотношение клеток-мишеней K562 и NK-эффекторных клеток составляет 1:5.
- Центрифуга в течение 5 мин при 135 x g.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу.
- Ресуспендируйте меченую NK-DiO клеточную смесь K562 в 500 мкл NK-клеточной среды без интерлейкина-2 (IL-2) и 2-меркаптоэтанола (2-ME) (неполная среда для культивирования NK-клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Неполная среда для культивирования NK-клеток представляет собой Minimum Essential Medium Eagle с бикарбонатом натрия, без L-глутамина, рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов.
- Добавьте 5 μL PI в каждую пробирку.
- Центрифугируйте в течение 2 мин при 163 x g.
- Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 2 ч.
- После 2-часовой инкубации центрифугировать в течение 2 минут при давлении 163 x g.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу.
- Ресуспендируйте клетки в неполной среде для культивирования NK-клеток объемом 25 мкл.
3. Приготовление спонтанного ("S") образца
- Пипетка 500 мкл меченых DiO клеток K562 (концентрация 1 x 106 клеток/мл) в пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте по 10 мкл PI в каждую пробирку.
- Центрифужная пробирка в течение 2 мин при 163 х г.
- Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 2 ч.
- После 2-часовой инкубации центрифугировать в течение 2 минут при давлении 163 x g.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу.
- Ресуспендируйте клетки в неполной среде для культивирования клеток с альфа-минимумом (α-MEM) объемом 25 мкл.
4. Сбор данных с помощью проточного цитометра
- Нажмите зеленую кнопку на передней дверце проточного цитометра, чтобы включить прибор.
- Включите все компьютеры, подключенные к проточному цитометру визуализации.
- Запустите программное обеспечение проточного цитометра для визуализации.
- Нажмите кнопку «Запуск», чтобы промыть систему и подготовить линию образца.
- После завершения «Запуска» закройте окно «Калибровки».
- Назначение каналов: в левом верхнем углу нажмите на каждый канал, чтобы назначить их.
- С правой стороны нажмите на кнопку точечной диаграммы, чтобы создать 4 диаграммы рассеивания: Raw Max Pixel _MC_6 против Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 против Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 против Area_M05 и FieldArea_M01 против AspectRatio_M01.
- Начните анализ образцов с использования элемента управления "Double Positive".
- Нажмите на кнопку «Загрузить».
- Поместите пробирку объемом 1,5 мл с образцом «Double Positive» с шага 1.4 по 1.8 в загрузчик образцов.
- Выберите объектив 40X на вкладке «Увеличение».
- Включите лазеры мощностью 405 мВт и 642 мВт.
- Включите канал "Brightfield".
- Нажмите на «Выбрать интенсивность».
- На основе контрольного образца "Double Positive" определите желаемую интенсивность для лазера мощностью 405 мВт, чтобы детектор не был перегружен.
заметка: Например, оптимальная интенсивность для этого эксперимента была установлена на уровне 11 мВт.
- После того, как желаемая настройка будет достигнута, соберите данные.
- На вкладке «Получение файла» введите текст пользовательского имени файла. Выберите папку для сохранения файлов данных.
- Введите количество ячеек для приобретения рядом с "Collect". Обычно это число колеблется от 1 000 до 10 000.
- Нажмите на кнопку "Приобрести."
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как будет получено желаемое количество ячеек, файл данных автоматически будет сохранен в ранее выбранной папке.
- После завершения сбора данных загрузите следующий контрольный образец – только контроль DiO.
- Нажмите на кнопку «Загрузить».
- Поместите пробирку объемом 1,5 мл с образцом «только DiO» в загрузчик образцов.
- Оставьте объектив 40X на вкладке «Увеличение» выбранным.
- Оставьте включенным лазер мощностью 405 мВт.
- Выключите лазер мощностью 642 мВт и канал "Brightfield".
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь, когда желаемая конфигурация достигнута, можно собирать данные.
- На вкладке "Получение файла" введите текст пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файлов данных. Введите количество ячеек для приобретения рядом с кнопкой "Collect". Обычно это число составляет 1 000.
- Нажмите на кнопку "Приобрести."
заметка: После того, как нужное количество ячеек получено, файл данных автоматически сохраняется в ранее выбранной папке.
- Повторите шаг 4.10 для контрольного образца «Только PI». В настоящее время экспериментальные образцы готовы к сбору.
- Обработайте оставшиеся экспериментальные образцы, включая «Спонтанные образцы 'S'» следующим образом:
- Оставьте объектив 40X на вкладке «Увеличение» выбранным.
- Включите лазеры мощностью 405 мВт и 642 мВт.
- Включите канал "Brightfield".
- Нажмите на «Установить интенсивность».
- На вкладке "Получение файла" введите текст пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файлов данных. Введите текст пользовательского имени файла.
- Введите количество ячеек для приобретения рядом с «Собрать».
- Нажмите на кнопку "Приобрести".
заметка: После того, как нужное количество ячеек получено, файл данных автоматически сохраняется в ранее выбранной папке.
- Повторите шаг 4.12 для всех экспериментальных образцов.
- После того, как все экспериментальные данные и файлы будут собраны, нажмите кнопку «Выключение» для стерилизации системы.
5. Анализ образцов с помощью проточного цитометра
- Откройте программное приложение для анализа проточных цитометров.
- В разделе «Файл» откройте экспериментальный файл. файл RIF.
- Постройте новую матрицу, используя один цвет. RIF (управление только DiO и управление только PI, созданные на этапах 4.10 и 4.11) путем выбора «Создать новую матрицу» на вкладке «Компенсация» в программном обеспечении проточного цитометра для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение предложит выбрать файлы одного цвета и объединить их для создания файла матрицы (расширение файла .ctm), который должен быть выбран для применения компенсации каналов.
- Создавайте точечные графики с помощью функции «Строительные блоки» программного обеспечения.
- Создайте точечную диаграмму (BrightFieldGradient_RMS в зависимости от частоты) для стробов сфокусированных ячеек. Назовите вентиль "Focus" (рисунок 1A).
- Используя вентиль "Фокус", создайте точечную диаграмму между областью светлого поля и соотношением сторон яркого поля, чтобы забить синглетные ячейки. Назовите ворота "Single" (рисунок 1B).
- Используя «одиночный» вентиль, создайте точечную диаграмму Intensity_MC_Ch02 и Intensity_MC_Ch5. Используйте этот график для идентификации и гейтирования только DiO-положительных клеток (мишени, живые) и двойных положительных клеток PI-DiO (мишени, мертвые) (рис. 1C).
заметка: Все участки, описанные в шагах 5.4.1, 5.4.2 и 5.4.3, могут быть созданы с помощью функции программного обеспечения «Строительные блоки».
- Нажмите на функцию статистики точечной диаграммы, чтобы получить доступ к номерам ячеек каждого вентиля.
- Рассчитайте процент мертвых целей в спонтанном образце и экспериментальных образцах по следующей формуле:
% мертвых целей в выборке = (#dead целей x 100)/(#live целей + #dead целей)
- Рассчитайте цитотоксичность по следующей формуле:
% цитотоксичности = [(Экспериментальный мертвый-Спонтанный мертвый)/(100-Спонтанный мертвый)]x100
