Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Общая подготовка прецизионно нарезанных ломтиков легких человека (PCLS) и последующее воздействие химических веществ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для заполнения легкого требуется два человека. Рекомендуется иметь актуальную запись о вакцинации против гепатита А и В. Перед трансплантацией легких пациенты регулярно проходят скрининг на вирус гепатита С (ВГС) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Если диагностирована или подозревается активная инфекция Mycobacterium tuberculosis, легкое должно быть отторгнуто. Тем не менее, вся свежая легочная ткань человека и полученные из нее образцы должны быть обработаны как потенциально заразные, и должны быть приняты соответствующие защитные меры (противоаэрозольные маски (FFP2), защитные очки, перчатки) для обеспечения безопасности труда персонала. Процедура занимает 60 - 90 минут.
- Подтвердите неповрежденность доли легкого человека.
заметка: Разрыв плевры препятствует однородному заполнению тканей. Материал легких человека должен быть со дня резекции. Допустимы сроки хранения около 2 ч при комнатной температуре (RT) перед заполнением агарозой на льду. Ткань, которую мы используем в этом протоколе, получена от пациентов, перенесших резекцию. Он не от умерших пациентов. Если ткань хранилась на льду, предварительно подогрейте ее до температуры перед заполнением, в противном случае агароза сразу же полимеризуется, и никакое однородное наполнение будет невозможно.
осторожность: Обеспечить, чтобы все лица, контактирующие с местным человеческим материалом, были одеты в защитную одежду, состоящую из лабораторного халата, двух пар перчаток, кепки, маски для лица и защитных очков. Человеческий материал потенциально заразен.
- Взвесьте 7,5 г низкожелирующей агарозы и добавьте ее в 250 мл бидистиллированной воды. Отварите агарозу в микроволновке до полного растворения агарозы. Охладите его примерно до 40 °C, в зависимости от температуры плавления и гелеобразования агарозы.
заметка: Требуется несколько колб, в зависимости от размера мочки.
- Предварительно подогреть и выдержать питательную среду (Таблица материалов) при температуре 37 °C.
заметка: Если агароза будет слишком горячей, витамины в питательной среде потеряют эффективность и клетки будут повреждены. Если температура среды/агарозного раствора ниже 37 °C, начнется процесс гелеобразования и нарушится однородное наполнение легкого. Рекомендуется использовать только диапазон температур от 37 °C до 39 °C.
- Перед началом работы поместите все необходимые материалы в пределах досягаемости: 5 - 10 зажимов, гибкий катетер длиной около 1 м, подходящий шприц (например, 50 мл) для подключения к катетеру, и холодильник, наполненный льдом.
- Канюлеируйте трахею/главный бронх, вставив силиконовую трубку и зафиксировав ее зажимом, ориентированным параллельно трубке, таким образом, чтобы зажим сжимал ткань вместе с силиконовой трубкой, не защемляя ее. Убедитесь, что силиконовая трубка зафиксирована внутри и не может выскользнуть во время процедуры заполнения. Закройте все остальные бронхи, сосуды и травмы зажимами, чтобы во время процедуры пломбирования не вытекла агароза.
- Смешайте эквивалентный объем 3% низкожелирующей агарозы с питательной средой в стакане. Закапывайте смесь в легкое с помощью шприца объемом 50 мл. Перед тем, как наполнить шприц медиумом, зажим закройте катетер пальцами или зажимом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и агарозного рефлюкса. Заполните долю легкого до тех пор, пока она полностью не надуется. Осторожно прикоснитесь к плевре легкого сбоку; Плевра должна быть ровной и твердой.
заметка: В зависимости от размера доли легкого может потребоваться до 2 или 3 л раствора агарозы/среды.
- Повторите шаги 1.5 - 1.6 для каждого бронха в случае нескольких бронхов в пределах одного экземпляра.
- Положите легкое на лед для полимеризации агарозы в гель на 20 - 40 мин, в зависимости от количества закапываемой агарозы. Осторожно коснитесь плевры с нескольких сторон, чтобы проверить, твердая ли она и прохладная, свидетельствующая о том, что полимеризация завершена, в противном случае продолжайте ждать. Патологоанатомы разрезают легкое на ломтики, берут их образцы и хранят легочный материал на льду для транспортировки.
- Острым ножом разрежьте легочную ткань человека на плиты по 3 - 5 см. <бр/>
заметка: Используйте новое лезвие для каждого легкого, чтобы обеспечить остроту.
- Наполните слайсер 400 мл ледяного сбалансированного раствора соли Эрла (EBSS). Немедленно вырежьте цилиндрические тканевые ядра из плит легких с помощью полуавтоматической отвертки с инструментом для отбора керна желаемого диаметра (например, 8 мм; 10 мм).
заметка: Этот диаметр должен быть эквивалентен диаметру держателя салфеток внутри аппарата.
- Отрегулируйте толщину ломтиков легких до желаемого значения толщины.
заметка: Толщина около 250 мкм обычно используется в экспериментах PCLS. Производитель слайсера рекомендует свой измеритель толщины среза ткани для проверки толщины среза. В качестве альтернативы можно использовать окрашивание всего монтирования в сочетании с конфокальной микроскопией для определения толщины среза, как описано в Brismar et al.
- Перенесите ядра тканей в держатель для салфеток слайсера. Положите груз (часть держателя для салфеток) поверх сердцевины ткани. Установите скорость руки и скорость лезвия на срезе для салфеток на 6. Начните нарезать тканевую сердцевину на PCLS.
- Добавьте 500 мл коммерчески доступной модифицированной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): смесь питательных веществ F-12 DMEM/F12 (1:1) с 5 мл пенициллина (10 000 единиц/мл) и стрептомицина (10 000 μг/мл). Храните питательную среду в течение нескольких дней в стерильных условиях в холодильнике. Предварительно прогревайте только необходимый объем среды. <бр/>
заметка: Пенициллин будет инактивирован при длительном хранении при температуре 37 °C. Используйте питательную среду без сыворотки и красителей, так как состав сыворотки варьируется от партии к партии, а красители, такие как фенол-красный, могут мешать анализам.
- Заполните чашку Петри (100 x 15 мм) 25 мл ледяной питательной среды. Среду следует слить из тканевого слайсера в стакан, открыв зажим стеклянного цилиндра. Переложите ломтики из стакана в чашку Петри с питательной средой с помощью аппликатора (например, петли инокуляции). Поместите чашку Петри в инкубатор (37 °C, 5% CO2, 100% влажности). Дайте среде нагреться перед этапами стирки.
заметка: Все дальнейшие действия выполняются в стерильных условиях.
- Поместите сетчатое фильтр в чашку Петри для промывки PCLS. Полностью удалите питательную среду с помощью серологической пипетки объемом 10 мл через сетчатое фильтр и добавьте 25 мл предварительно подогретой свежей среды при температуре 37 °C. Повторяйте этот шаг 3 - 4 раза каждые 30 мин. <бр/>
заметка: Сетчатый фильтр предотвращает всасывание ломтиков в пипетку, что позволяет избежать их повреждения.
- Осторожно переложите срезы легких в 24-луночный культуральный планшет с минимальным содержанием 500 мкл питательной среды для двух срезов на лунку. Подвергайте легочную ткань воздействию веществ (см. шаги 3.1 - 3.4), например, в течение 24 ч при 37 °C, 5%CO2.
заметка: Для переноса предпочтительно использовать петлю для инокуляции и позволить ломтикам плавать на петле, чтобы предотвратить повреждение тканей. Дальнейшее разделение срезов не требуется, так как только нехватка достаточного количества свежей среды вызовет гибель клеток в срезах тканей. Срезы могут накладываться друг на друга или соприкасаться друг с другом в лунке: это никак не влияет на жизнеспособность тканей.
- Поместите весь оставшийся человеческий материал в пластиковую колбу с фиксатором (например, 10% буферизованного формальдегида) не менее чем на 24 часа и сожгите его в процессе утилизации><.
осторожность: Формальдегид токсичен, выполняйте этот этап под вытяжкой.
2. Приготовление растворов для веществ
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте рабочие решения и элементы управления непосредственно перед использованием.
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с веществами в соответствии с инструкциями по технике безопасности или, если неизвестно, как с потенциально вредными, и соблюдайте обычные меры предосторожности.
- Растворяют водорастворимые вещества непосредственно в питательной среде. Для нерастворимых или плохо растворимых химических веществ сначала растворите вещество в соответствующих растворителях в зависимости от растворимости вещества. Вещества с ограниченной растворимостью в воде (<0,1 мг/мл) могут быть растворены, например, в диметилсульфоксиде (ДМСО) или этаноле. Концентрации нетоксичных растворителей следует предварительно определять путем титрования. Следите за тем, чтобы вещества не выпадали в осадок из раствора при разбавлении в среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: приготовлены растворы гексахлорплатината аммония (HClPt) и лауретсульфата натрия (SLS).
- Готовьте исходные растворы вещества при 100-кратной максимальной концентрации в питательной среде или растворителе. Взвесьте 12,5 мг HClPt и 34,4 мг SLS и приготовьте исходные растворы, растворив химикаты в 1 мл питательной среды.
заметка: Для этих химических веществ не требуется растворитель.
- Приготовьте окончательное разведение 1:100 в предварительно подогретой среде. В случае предварительного использования растворителя такой подход приводит к одинаковой конечной концентрации растворителя для всех концентраций вещества.
- Используйте концентрацию растворителя (например, 1%, как описано в шаге 3.3) для референтной обработки PCLS. Контроль растворителями для химических веществ, упомянутых в разделе результатов, не требовался.
3. Положительные и отрицательные ссылки на анализы цитотоксичности
- Для всех анализов жизнеспособности подготовьте следующие положительные и отрицательные контрольные показатели:
- Тканевый контроль: инкубировать PCLS в культуральной среде только в качестве эталона для необработанных PCLS в течение 24 ч в условиях культивирования клеток (37 °C, 5%CO2, 100% влажности).
- Контроль транспортного средства (при необходимости): инкубировать PCLS с конечной концентрацией растворителя в качестве эталона для PCLS, обработанного только транспортным средством (см. шаг 3.4) в течение 24 ч в условиях культивирования клеток (37 °C, 5%CO2, 100% влажности).
- Положительный контроль: инкубировать PCLS с 1% моющим средством в буферном растворе в течение 1 ч при 4 °C.
заметка: Если PCLS становится бесцветной, ткань мертва. Общая L-лактатдегидрогеназа (ЛДГ) определяется в надосадочной жидкости, с абсорбцией примерно 1,9 - 2,3. Ткань используется для анализа WST-1 с абсорбцией около 0.
4. Измерение химически индуцированной цитотоксичности в PCLS человека с помощью анализа водорастворимой соли тетразолия (WST-1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ WST-1 проводится в 24-луночном планшете с двумя PCLS на лунку. Предпочтительно использовать дубликаты для каждого параметра и объединять результаты этих дубликатов после измерения.
- Готовьте рабочий раствор, разводя реагент WST-1 в среде непосредственно перед пуском. Необходимое количество рабочего раствора составляет 250 μл/лунку 24-луночного планшета. Поэтому смешайте 25 мкл реагента с 225 мкл питательной среды для одной лунки.
- После инкубации PCLS на этапе 1.16 выбросьте или используйте надосадочную жидкость для измерения цитокинов или других тестов, таких как анализ LDH. Оставшаяся ткань используется для следующего шага.
- Нанесите 250 мкл рабочей концентрации реагента WST-1 в лунку и инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 1 ч. Убедитесь, что PCLS полностью покрыты реагентом WST-1 во время инкубации.
- Поместите пластину на орбитальный шейкер (200 об/мин) и осторожно встряхивайте в течение 30 с, чтобы обеспечить тщательное перемешивание реагента WST-1. Возьмите новый 96-луночный планшет с плоским дном и наберите 100 мкл в двух экземплярах из надосадочной жидкости каждой лунки 24-луночного планшета.
- Измерьте поглощение каждой лунки на длине волны 450 нм (артикул: 630 нм) с помощью считывателя микропланшетов. Вычтите поглощение на длине волны 630 нм из 450 нм. заметка: Достоверные данные для оценки цитотоксичности можно получить только из жизнеспособной ткани. Таким образом, эти опубликованные критерии приемлемости должны быть соблюдены в каждом эксперименте. Если эти критерии не выполняются, эксперимент следует повторить.
- Абсорбция контроля необработанной среды должна быть выше 0,6, в противном случае эксперимент следует повторить. Если данные соответствуют этому требованию, установите значение поглощения тканевого контроля на 100% и рассчитайте снижение WST-1 обработанных образцов по отношению к тканевому контролю.
