Флуоресцентный анализ с использованием сконструированных лимфоцитов для скрининга иммуномодулирующих соединений

Abstract

Источник: Fouda, A., et al., Анализ лимфоцитов на основе флуоресценции, подходящий для высокопроизводительного скрининга малых молекул. J. Vis. Exp., (2017).

Это видео демонстрирует скрининг иммуномодулирующих соединений с помощью флуоресцентного анализа. Трансгенные Т-лимфоциты, полученные от мышей, с зелеными кассетами для экспрессии флуоресцентных белков обрабатываются этими соединениями. Усиленные и пониженные сигналы GFP позволяют идентифицировать стимулирующие и ингибирующие эффекты соединений соответственно.

Protocol

1. Получение среды спленоцитов и буфера проточной цитометрии

1. Выполняйте все действия под биологическим колпаком, очищенным на 70% этанолом.
2. Извлеките 70 мл предварительно подогретой среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (имеется в продаже и поставляется в стерильных флаконах объемом 500 мл с фильтрами) и поместите в стерильную пробирку. Удаленная среда будет использована позже в протоколе.
3. Дополните оставшиеся 430 мл RPMI 1640 1x 50 мл инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина/стрептомицина, 5 мл N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этановой сульфоновой кислоты (HEPES), 5 мл заменимых аминокислот, 5 мл пирувата натрия и 0,05 мл фильтрованного (1M) 2-меркаптоэтанола.
   заметка: Предварительно подогрейте среду спленоцитов с помощью водяной бани, установленной при температуре 37 ºC, чтобы избежать теплового шока клеток. Это важно для того, чтобы избежать индукции клеточного апоптоза.
4. Чтобы приготовить буфер для проточной цитометрии, добавьте 2 мл FBS к 98 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и храните в холодильнике до использования (предпочтительно в течение трех дней).

2. Генерация суспензии клеток спленоцитов из селезенки мыши Nur77^GFP

1. Асептически изолируйте селезенку от 6-8-недельной самки мыши Nur77^GFP.
   1. Чтобы этого добиться, работают под стерильным капюшоном. Смочите пожертвованный мышиный мех, ножницы и щипцы в 70% этаноле.
   2. Положите мышь на правый бок, а кожу и мышцы разрежьте в верхнем левом брюшном квадранте. Осмотрите область разреза, чтобы увидеть селезенку, а затем вырежьте ее. Держите селезенку в среде спленоцитов на льду до тех пор, пока не будете готовы к выполнению следующего этапа.
2. Поместите селезенку (селезенки) в чашку Петри размером 10 см² для клеточной культуры, содержащую 5 мл предварительно подогретой среды спленоцитов.
3. Разомните селезенку с помощью стерильного поршня шприца до тех пор, пока раствор не помутнеет. Коллагеновый матрикс селезенки должен остаться к концу процедуры.
4. После интенсивного растирания в среде спленоцитов соберите клеточную суспензию и пропустите ее через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, помещенное в пробирку объемом 50 мл, чтобы отфильтровать любой мусор или сгустки.
5. Центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2-3 мл буфера для лизиса эритроцитов собственного производства или в коммерческих целях. После пипетирования (2-3 раза) дать суспензии отдохнуть 20-30 с.
6. Добавьте 5 мл PBS или подходящий буфер по выбору, затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 минут при 500 x g.
7. Удалите надосадочную жидкость (она должна быть красного цвета, так как она содержит лизированные эритроциты) и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл среды спленоцитов.
8. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток, окрашенных трипановым синим, чтобы дифференцировать живые и мертвые (некротические) клетки.

3. Выделение Т-клеток из суспензии клеток спленоцитов

1. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 500 x g. Ресуспендируйте клетки в бессывороточной среде RPMI (50 мл на шаге 1.3) до получения клеточной концентрации 10 x 10⁶ клеток/мл.
2. Перенесите клетки в полистирольную пробирку объемом 5 мл и отложите 100 мкл аликвоты спленоцитов для оценки/сравнения чистоты в конце этапа очистки.
3. Добавьте в клеточную суспензию нормальную сыворотку крысы в концентрации 50 мкл/мл с последующим введением коктейля антител для выделения Т-клеток (50 мкл/мл).
4. Смешайте клеточную суспензию и дайте ей отдохнуть 10 минут. Этот шаг позволяет коктейлю антител связывать все нежелательные клетки.
5. Добавьте стрептавидин быстрые сферы (магнитные шарики) в течение 2,5 минут, затем доведите объем до 2,5 мл с помощью среды, не содержащей сыворотки.
6. Поместите пробирку в магнит для изоляции клеток на 3 минуты.
7. Перенесите суспензию Т-клеток в новую полистирольную трубку, удерживая магнит и выливая раствор одним движением.
   заметка: Выделенная суспензия содержит очищенные Т-клетки. Все нежелательные клетки удерживаются на стороне трубки, связанной с магнитными шариками стрептавидина.
8. Подсчитайте количество выделенных Т-клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
   заметка: На этом этапе чистота выделенных Т-клеток может быть проверена (опционально) путем анализа процента событий CD3⁺ до и после выделения Т-клеток с помощью проточной цитометрии.
   1. Кратко центрифугируйте 1 мл суспензии клеток спленоцитов в дозе 500 х г. Отбросьте надосадочную жидкость и суспензируйте клетки в буфере для проточной цитометрии в концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл.
   2. Добавьте флуоресцентное меточное антитело против мыши CD3 в концентрации 1:100. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут. Промыть один раз, центрифугировать и повторно суспендировать в буфере проточной цитометрии (400 мкл) для анализа с помощью проточной цитометрии.

4. Активация Т-клеток и индукция экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP)

1. Засейте Т-клетки в суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном в концентрации 2,5 x 10⁵ клеток/лунку.
2. Добавьте рекомбинантный интерлейкин (ИЛ)-7 в концентрации 2 нг/мл и магнитные гранулы CD3/CD28 (25 мкл/10⁶ клеток). Держите часть Т-клеток необработанной с помощью гранул, чтобы они служили отрицательным контролем для последующих измерений, которые представляют неактивированные Т-клетки.
3. Через 12 часов соберите Т-клетки из 96-луночного планшета, осторожно пипетируя клеточную суспензию в каждой лунке вверх и вниз, чтобы разрушить любой комплекс/агрегаты из гранул-клеток. Соберите суспензию из всех лунок в полистирольную трубку объемом 5 мл.
4. Поместите пробирку с суспензией внутрь того же магнита для изоляции клеток, который ранее использовался для очистки Т-клеток, и дайте ей отдохнуть в течение 5 минут.
5. Перенесите суспензию Т-клеток в новую полистирольную трубку, удерживая магнит и выливая раствор одним движением.
6. Центрифугируйте клетки при давлении 500 x g в течение 5 мин. Повторно суспендируйте клетки в свежей среде спленоцитов до получения концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл.
7. Оценивайте интенсивность экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии (необязательно для контроля качества) через 12–24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированными Т-клетками. ¹²<чел. /> заметка: Флуоресценция GFP присуща Т-клеткам Nur77^GFP и проявляется при успешной активации Т-клеточного рецептора TCR.
8. Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопии окрашивают активированные клетки препаратом Hoechst за 30 мин до анализа в концентрации 0,2 мкг/мл. Добавьте достаточный объем клеточной суспензии на покровное предметное стекло или лунку плоскодонного черностороннего 384-луночного планшета и исследуйте под флуоресцентным микроскопом для оценки живых клеток. Мертвые клетки не сохраняют ядерное окрашивание.

5. Высокопроизводительный скрининг (HTS) малых молекул

1. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл активированных Т-клеток (магнитных шариков или антител/CD40L) или неактивированных групп.
2. Планшет 75 000 ячеек/лунка в 384-луночном планшете (объем 40 мкл). Используйте 384-луночный планшет с плоским дном и черными стенками или предметное стекло для микроскопа для оценки жизнеспособности и активации с помощью флуоресцентной микроскопии (дополнительный этап контроля качества перед HTS) с использованием красителя Hoechst (подробнее см. шаги 4.8).
3. Вручную или с помощью автоматизированной системы добавьте в каждую лунку препараты по выбору (растворенные в 0,5% диметилсульфоксиде, ДМСО).
4. Добавьте транспортное средство (ДМСО) в положительные (активированные) и отрицательные (неактивированные) контрольные колодцы. Отрегулируйте концентрацию ДМСО до максимума 0,5%.
5. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов (или времени инкубации по выбору) при температуре 37 ºC и 5% углекислом газе, CO₂.
6. В день скрининга разбавьте раствор красителя Hoechst 33342 (1:3333; например, добавьте 10 мкл к ячейкам в 384-луночных планшетах, чтобы получить общий объем 50 мкл). Окрашивайте за 30 минут до анализа GFP, добавляя раствор Хёхста до концентрации 0,2 мкг/мл.
7. Осторожно пипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы получить равномерное распределение в каждой лунке.
   заметка: Этот шаг важен в случае дозирования лекарственных препаратов (шаг 5.3) с использованием автоматизированной системы, поскольку клетки имеют тенденцию накапливаться на одной стороне лунки, противоположной направлению потока.
8. Вращайте пластины при температуре 45 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
9. Оставьте тарелки отдыхать на 15 минут при комнатной температуре.
10. Выполните считывание показаний пластин с помощью автоматизированной конфокальной системы просеивания высокого содержания (HCS). Загрузите пластину в машину. Установите объектив на 40-кратное или более увеличение. Используйте камеру #4 для Hoechst (УФ-лампа) и камеру #1 для GFP (лазер 488). Настройте машину на считывание 6-10 полей на лунку. Настройте машину так, чтобы она выполняла два последовательных считывания на каждом поле с длиной волны 488 нм (для чтения GFP) и ультрафиолетового излучения (для чтения Hoechst). Установите объектив на 40-кратное или более увеличение.
    заметка: Система представляет собой компьютеризированный микроскоп, который не требует никаких регулировок. Фокусное расстояние, интенсивность падающего света и время экспозиции настраиваются машиной автоматически.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Мыши Nur77GFP	Лаборатория Джексона	Штамм мышей No 016617	На нашем животноводческом предприятии была создана домашняя колония
96 лунок-U планшетов для культивирования, стерильных	VWR Интернэшнл	10062-902	Активация Т-клеток с помощью магнитных шариков
Клеточное ситечко 70 мкм, стерильное	Компания Corning Inc.	No 352350 (Английский	Генерация суспензии клеток спленоцитов
Трубки с круглым дном из полистирола 5 мл, стерильные	Компания Corning Inc.	352058	Генерация суспензии клеток спленоцитов
50 мл полипропиленовые конические донные трубки, стерильные	VWR Интернэшнл	89039-656	Генерация суспензии клеток спленоцитов
Шприц 10 мл без иглы, стерильный	Бектон, Дикинсон и компания	305482	Размять селезенку
Чашка для клеточных культур 5 мл, стерильная	Greiner Bio-One	Телефон: 627 160	Размять селезенку
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	WISENT Inc.	450-200-ЭЛ	Компонент среды спленоцитов
RPMI 1600 с бикарбонатом натрия и L-глутамином	WISENT Inc.	350-002-КЛ	Компонент среды спленоцитов
Заменимые аминокислоты MEM	WISENT Inc.	321-010-ЭЛ	Компонент среды спленоцитов
HEPES свободная кислота 1 М	WISENT Inc.	330-050-ЭЛ	Компонент среды спленоцитов
Раствор пирувата натрия (100мМ)	WISENT Inc.	600-110-ЭЛ	Компонент среды спленоцитов
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	WISENT Inc.	Тел.: 080-910	Компонент среды спленоцитов и буфера проточной цитометрии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	WISENT Inc.	311-010-КЛ	Компонент буфера проточной цитометрии
2-Меркаптоэтанол (55 мМ)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Компонент среды спленоцитов
Набор для изоляции Т-клеток	Технологии стволовых клеток	19851	Для выделения Т-клеток
Мышь T-Activator CD3/CD28 суперпарамагнитные бусины	Thermo Fisher Scientific	11452Д	Для активации Т-клеток
Магнит для изоляции ячеек	Технологии стволовых клеток	18000	Для выделения Т-клеток и удаления магнитных шариков
Мышиный рекомбинантный ИЛ-7	Пепротех	217-17	Для поддержки выживания Т-клеток во время активации
Антитела к мышиному CD3	BD Pharmingen	561799	Окрашивание Т-клеток для проточной цитометрии
Биомед FXp	PerkinElmer Inc.	А31842	Для повторной суспензии клеток после 24 часов инкубации
Opera Phenix Система скрининга с высоким содержанием	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Анализ сигнала GFP/Hoechst