1. Получение среды спленоцитов и буфера проточной цитометрии
- Выполняйте все действия под биологическим колпаком, очищенным на 70% этанолом.
- Извлеките 70 мл предварительно подогретой среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (имеется в продаже и поставляется в стерильных флаконах объемом 500 мл с фильтрами) и поместите в стерильную пробирку. Удаленная среда будет использована позже в протоколе.
- Дополните оставшиеся 430 мл RPMI 1640 1x 50 мл инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина/стрептомицина, 5 мл N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этановой сульфоновой кислоты (HEPES), 5 мл заменимых аминокислот, 5 мл пирувата натрия и 0,05 мл фильтрованного (1M) 2-меркаптоэтанола.
заметка: Предварительно подогрейте среду спленоцитов с помощью водяной бани, установленной при температуре 37 ºC, чтобы избежать теплового шока клеток. Это важно для того, чтобы избежать индукции клеточного апоптоза.
- Чтобы приготовить буфер для проточной цитометрии, добавьте 2 мл FBS к 98 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и храните в холодильнике до использования (предпочтительно в течение трех дней).
2. Генерация суспензии клеток спленоцитов из селезенки мыши Nur77GFP
- Асептически изолируйте селезенку от 6-8-недельной самки мыши Nur77GFP.
- Чтобы этого добиться, работают под стерильным капюшоном. Смочите пожертвованный мышиный мех, ножницы и щипцы в 70% этаноле.
- Положите мышь на правый бок, а кожу и мышцы разрежьте в верхнем левом брюшном квадранте. Осмотрите область разреза, чтобы увидеть селезенку, а затем вырежьте ее. Держите селезенку в среде спленоцитов на льду до тех пор, пока не будете готовы к выполнению следующего этапа.
- Поместите селезенку (селезенки) в чашку Петри размером 10 см2 для клеточной культуры, содержащую 5 мл предварительно подогретой среды спленоцитов.
- Разомните селезенку с помощью стерильного поршня шприца до тех пор, пока раствор не помутнеет. Коллагеновый матрикс селезенки должен остаться к концу процедуры.
- После интенсивного растирания в среде спленоцитов соберите клеточную суспензию и пропустите ее через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, помещенное в пробирку объемом 50 мл, чтобы отфильтровать любой мусор или сгустки.
- Центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2-3 мл буфера для лизиса эритроцитов собственного производства или в коммерческих целях. После пипетирования (2-3 раза) дать суспензии отдохнуть 20-30 с.
- Добавьте 5 мл PBS или подходящий буфер по выбору, затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 минут при 500 x g.
- Удалите надосадочную жидкость (она должна быть красного цвета, так как она содержит лизированные эритроциты) и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл среды спленоцитов.
- С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток, окрашенных трипановым синим, чтобы дифференцировать живые и мертвые (некротические) клетки.
3. Выделение Т-клеток из суспензии клеток спленоцитов
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 500 x g. Ресуспендируйте клетки в бессывороточной среде RPMI (50 мл на шаге 1.3) до получения клеточной концентрации 10 x 106 клеток/мл.
- Перенесите клетки в полистирольную пробирку объемом 5 мл и отложите 100 мкл аликвоты спленоцитов для оценки/сравнения чистоты в конце этапа очистки.
- Добавьте в клеточную суспензию нормальную сыворотку крысы в концентрации 50 мкл/мл с последующим введением коктейля антител для выделения Т-клеток (50 мкл/мл).
- Смешайте клеточную суспензию и дайте ей отдохнуть 10 минут. Этот шаг позволяет коктейлю антител связывать все нежелательные клетки.
- Добавьте стрептавидин быстрые сферы (магнитные шарики) в течение 2,5 минут, затем доведите объем до 2,5 мл с помощью среды, не содержащей сыворотки.
- Поместите пробирку в магнит для изоляции клеток на 3 минуты.
- Перенесите суспензию Т-клеток в новую полистирольную трубку, удерживая магнит и выливая раствор одним движением.
заметка: Выделенная суспензия содержит очищенные Т-клетки. Все нежелательные клетки удерживаются на стороне трубки, связанной с магнитными шариками стрептавидина.
- Подсчитайте количество выделенных Т-клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
заметка: На этом этапе чистота выделенных Т-клеток может быть проверена (опционально) путем анализа процента событий CD3+ до и после выделения Т-клеток с помощью проточной цитометрии.
- Кратко центрифугируйте 1 мл суспензии клеток спленоцитов в дозе 500 х г. Отбросьте надосадочную жидкость и суспензируйте клетки в буфере для проточной цитометрии в концентрации 1 x 106 клеток/мл.
- Добавьте флуоресцентное меточное антитело против мыши CD3 в концентрации 1:100. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут. Промыть один раз, центрифугировать и повторно суспендировать в буфере проточной цитометрии (400 мкл) для анализа с помощью проточной цитометрии.
4. Активация Т-клеток и индукция экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP)
- Засейте Т-клетки в суспензии в 96-луночный планшет с круглым дном в концентрации 2,5 x 105 клеток/лунку.
- Добавьте рекомбинантный интерлейкин (ИЛ)-7 в концентрации 2 нг/мл и магнитные гранулы CD3/CD28 (25 мкл/106 клеток). Держите часть Т-клеток необработанной с помощью гранул, чтобы они служили отрицательным контролем для последующих измерений, которые представляют неактивированные Т-клетки.
- Через 12 часов соберите Т-клетки из 96-луночного планшета, осторожно пипетируя клеточную суспензию в каждой лунке вверх и вниз, чтобы разрушить любой комплекс/агрегаты из гранул-клеток. Соберите суспензию из всех лунок в полистирольную трубку объемом 5 мл.
- Поместите пробирку с суспензией внутрь того же магнита для изоляции клеток, который ранее использовался для очистки Т-клеток, и дайте ей отдохнуть в течение 5 минут.
- Перенесите суспензию Т-клеток в новую полистирольную трубку, удерживая магнит и выливая раствор одним движением.
- Центрифугируйте клетки при давлении 500 x g в течение 5 мин. Повторно суспендируйте клетки в свежей среде спленоцитов до получения концентрации 2 x 106 клеток/мл.
- Оценивайте интенсивность экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии (необязательно для контроля качества) через 12–24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированными Т-клетками. 12<чел. />
заметка: Флуоресценция GFP присуща Т-клеткам Nur77GFP и проявляется при успешной активации Т-клеточного рецептора TCR.
- Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопии окрашивают активированные клетки препаратом Hoechst за 30 мин до анализа в концентрации 0,2 мкг/мл. Добавьте достаточный объем клеточной суспензии на покровное предметное стекло или лунку плоскодонного черностороннего 384-луночного планшета и исследуйте под флуоресцентным микроскопом для оценки живых клеток. Мертвые клетки не сохраняют ядерное окрашивание.
5. Высокопроизводительный скрининг (HTS) малых молекул
- Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 2 x 106 клеток/мл активированных Т-клеток (магнитных шариков или антител/CD40L) или неактивированных групп.
- Планшет 75 000 ячеек/лунка в 384-луночном планшете (объем 40 мкл). Используйте 384-луночный планшет с плоским дном и черными стенками или предметное стекло для микроскопа для оценки жизнеспособности и активации с помощью флуоресцентной микроскопии (дополнительный этап контроля качества перед HTS) с использованием красителя Hoechst (подробнее см. шаги 4.8).
- Вручную или с помощью автоматизированной системы добавьте в каждую лунку препараты по выбору (растворенные в 0,5% диметилсульфоксиде, ДМСО).
- Добавьте транспортное средство (ДМСО) в положительные (активированные) и отрицательные (неактивированные) контрольные колодцы. Отрегулируйте концентрацию ДМСО до максимума 0,5%.
- Инкубируйте планшеты в течение 24 часов (или времени инкубации по выбору) при температуре 37 ºC и 5% углекислом газе, CO2.
- В день скрининга разбавьте раствор красителя Hoechst 33342 (1:3333; например, добавьте 10 мкл к ячейкам в 384-луночных планшетах, чтобы получить общий объем 50 мкл). Окрашивайте за 30 минут до анализа GFP, добавляя раствор Хёхста до концентрации 0,2 мкг/мл.
- Осторожно пипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы получить равномерное распределение в каждой лунке.
заметка: Этот шаг важен в случае дозирования лекарственных препаратов (шаг 5.3) с использованием автоматизированной системы, поскольку клетки имеют тенденцию накапливаться на одной стороне лунки, противоположной направлению потока.
- Вращайте пластины при температуре 45 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
- Оставьте тарелки отдыхать на 15 минут при комнатной температуре.
- Выполните считывание показаний пластин с помощью автоматизированной конфокальной системы просеивания высокого содержания (HCS). Загрузите пластину в машину. Установите объектив на 40-кратное или более увеличение. Используйте камеру #4 для Hoechst (УФ-лампа) и камеру #1 для GFP (лазер 488). Настройте машину на считывание 6-10 полей на лунку. Настройте машину так, чтобы она выполняла два последовательных считывания на каждом поле с длиной волны 488 нм (для чтения GFP) и ультрафиолетового излучения (для чтения Hoechst). Установите объектив на 40-кратное или более увеличение.
заметка: Система представляет собой компьютеризированный микроскоп, который не требует никаких регулировок. Фокусное расстояние, интенсивность падающего света и время экспозиции настраиваются машиной автоматически.
