$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Настройка прибора
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация левитирующих элементов требует, чтобы два магнита редкоземельных неодима, намагниченных по оси z, были размещены одним и тем же полюсом друг против друга для создания магнитного поля. Расстояние между магнитами можно настроить в зависимости от интенсивности магнитного поля и плотности мишеней. В этом случае магниты разделены пространством 1 мм, достаточным для введения квадратной стеклянной капиллярной трубки длиной 50 мм 1x1 мм. Устройство было напечатано на 3D-принтере по проекту AutoCAD, который предоставляется по запросу.
- Положите микроскоп на бок, идеально горизонтально.
заметка: Микроскоп, установленный в стандартном вертикальном положении, не подходит непосредственно для визуализации левитирующих объектов из-за расположения магнитов по отношению к конденсору и объективу. Это ограничение можно обойти, положив микроскоп на бок, идеально горизонтально, что позволит конденсору фокусировать свет в капилляре, а линзе объектива — визуализировать ячейку, левитирующую между магнитами, сохраняя при этом требования к освещению по Келеру.
- Поддерживайте и выравнивайте стенд на макетном столе с помощью 2 или 3 лабораторных гнезд.
- Чтобы ограничить вибрацию, подперейте макетный стол резиновыми демпфирующими ножками.
- Снимите предметный столик и замените его компактным лабораторным домкратом для регулировки высоты левитирующего устройства (ось y) и двумя одноосевыми поступательными столиками: один для регулировки фокуса (ось z), а второй — для сканирования капиллярной трубки.
- Прикрепите устройство магнитной левитации к лабораторному гнезду с помощью двух оптических стоек мини-серии.
2. Связывание антитела с карбоксимикрочастицами/шариками (модифицировано из протокола PolyAn)
ПРИМЕЧАНИЕ: Только шарики низкой плотности (1,05 г/мл) должны быть покрыты для обнаружения резус-фактора, Rh(+), но для обнаружения внеклеточных везикул покрываются как бусины высокой, так и низкой плотности.
- Достаньте 1 мг эквивалента суспензии в гранулах и добавьте в 0,5 мл активационного буфера (50 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты, MES (MW195,2, 9,72 мг в 1 мл)) pH 5,0 и 0,001% полисорбата-20).
- Добавьте 12 мкл свежеприготовленного 1,5 М 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) (MW 191,7, 0,28755 г в 1 мл) и 12 мкл 0,3 М сульфо-N-гидроксисукцинимида (NHS) (MW 217,14, 0,0651 г в 1 мл) в ледяную воду.
- Поместите пробирки на орбитальный шейкер и энергично встряхивайте в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы активировать карбоксильные группы на шариках.
- Прекратите активацию через 1 ч, добавив 0,5 мл буфера для связывания (10x фосфатно-солевой буфер, PBS, или 0,1 М фосфата pH 7-9).
- Гранулируйте гранулы центрифугированием при температуре 20 000 x g в течение 10 минут или, если гранулы не могут быть гранулированы, используйте центрифужный трубчатый фильтр 0,45 мкм. Отсасывайте надосадочную жидкость или проточные.
- Промойте шарики 1 мл 10x PBS 3 раза, как в шаге 2.5.
- Рассчитайте концентрацию 25 мкг антител на мг гранул и смешайте желаемое антитело с активированными гранулами до конечной концентрации антитела 0,7-1,0 мг/мл в 10-кратном PBS.
- Поместите трубки на трубчатое коромысло, установленное на низкой скорости. Аккуратно сверните трубки при комнатной температуре на ночь для соединения.
- Повторите шаг 2.5 и дважды промойте бусины 1 мл 10x PBS.
- Промыть 0,5 мл 1 М этаноламина, содержащего 98% бульона = 16,2 М, в буфере pH 8,0 с 0,02% полисорбата-20 в течение 1 ч при комнатной температуре, слегка встряхивая.
- Повторите шаг 2.5 и промойте шарики один раз в 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS). Шарики можно хранить в 200 μл DPBS при температуре 4 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
3. Сбор и подготовка крови для определения резус(+)
- С помощью устройства для прокалывания одним щелчком мыши уколите палец донора резус(+) и соберите 10 мкл крови в 1 мл DPBS.
- Окрашивайте клетки Rh+ флуоресцентным красителем на плазматической мембране. По желанию добавьте 1 мкл флуоресцентного красителя к 1 мл суспензии Rh+ клеток (разведение 1:1000).
- Инкубируйте клетки с флуоресцентным красителем при 37 °C в течение 15 минут.
- Гранулируйте ячейки методом отжима при 5 600 x g в течение 15 с и промойте 3 раза, используя 1 мл DPBS. Ресуспендировать в 1 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) с кальцием и магнием (HBSS++).
- С помощью устройства для прокалывания одним щелчком мыши уколите палец донора резус-фактора (-) и соберите 2 мкл крови.
заметка: При подготовке более 2 условий соберите достаточное количество крови, чтобы добавить 1 мкл резус-фактора крови в каждую пробирку.
- Подготовьте необходимые экспериментальные пробирки: только бусины, контроль иммуноглобулина G (IgG), образец.
- Только гранулы: добавьте 174 μL HBSS++, 1 μL контрольных бусин IgG, 1 μL гранул высокой плотности (1,2 г/мл) и 24 μL 500 мМ Gd3+ (60 мМ).
- Контроль IgG: добавьте 172 мкл HBSS++, 1 мкл контрольных гранул IgG, 1 мкл гранул высокой плотности, 1 мкл резус-крови, 1 мкл окрашенной суспензии крови Rh+ и 24 мкл 500 мМ Gd3+.
- В пробирку с образцом добавьте 172 мкл HBSS++, 1 мкл гранул, покрытых анти-RhD, 1 мкл гранул высокой плотности, 1 мкл резус-крови, 1 мкл окрашенной резус-(+) кровяной суспензии и 24 мкл 500 мМ Gd3+,
заметка: Гранулы высокой плотности добавляются к образцам резус-фактора для справки.
4. Анализ ячеек на устройстве магнитной левитации
- Выполните ввод прибора в эксплуатацию в соответствии с инструкциями производителя.
- Загрузите 50 мкл образца в капиллярную пробирку до тех пор, пока пробирка не заполнится. Загерметизируйте концы капиллярной трубки капиллярным герметиком, убедившись, что на них нет пузырьков воздуха.
- Загрузите капиллярную трубку в держатель между верхним и нижним магнитами. Отрегулируйте сцену и фокус для оптимального просмотра.
заметка: Клеткам/шарикам может потребоваться от 5 до 20 минут, чтобы достичь своего магнитного равновесия в зависимости от их плотности и концентрации Gd3+. Чем выше концентрация Gd3+, тем короче время.