Методика in vitro для изучения взаимодействия Т-клеток с поддерживаемыми планарными липидными бислоями

Аннотация

Источник: Стеблянко, М., и др. Оценка синаптического интерфейса первичных Т-клеток человека из периферической крови и лимфоидной ткани. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод in vitro для изучения формирования иммунных синапсов между первичными Т-клетками человека и поддерживаемыми липидными бислоями (SLB). Поверхностные белки Т-клеток взаимодействуют с соответствующими лигандами, иммобилизованными на SLB, образуя иммунный синапс, с последующим движением литических гранул к синапсу, который визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Выделение CD4⁺ Т-клеток для анализа изображений

1. Разморозьте 1 мл аликвоты, содержащей 10⁷ замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или мононуклеарных клеток лимфатических узлов (LNMC) из собранных образцов. В стерильном колпаке добавьте размороженные клетки в 9 мл RPMI с добавлением пенициллина/стрептомицина и глутамина.
   1. Центрифугировать клетки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C, отсасывать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 5 мл дополненного RPMI, содержащего 10% FBS (полная среда). Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с_CO2 при температуре 37 °C.
2. На следующий день очистите CD4⁺ Т-клетки методом отрицательной иммуномагнитной сортировки с помощью коммерчески доступного набора в соответствии с инструкцией производителя.
3. Чтобы измерить количество свежеочищенных CD4⁺ Т-клеток, смешайте 5 мкл клеточной суспензии с равным объемом раствора трипанового синего. Загрузите в гемоцитометр клеточно-трипановую синюю смесь и подсчитайте живые клетки внутри 5 секций гемоцитометра.
4. Возьмите среднее значение числа клеток и определите количество клеток в исходной клеточной суспензии: количество клеток/1 мл = среднее количество x 2 x 10⁴. Если общее количество выделенных клеток слишком мало, используйте клетки как есть, не подсчитывая.
5. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин и ресуспендируйте их в буфере для анализа (20 мМ HEPES, pH 7,4, 137 мМ NaCl, 2 мМ Na₂HPO₄, 5 мМ D-глюкоза, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 2 мМ CaCl₂ и 1% сывороточного альбумина человека) при концентрации 10⁵ клеток/50 мкл или менее и выдерживайте клетки при температуре 4 °C (в течение 1–2 ч) до готовности использование в экспериментах.
6. Утилизируйте все биологические отходы в соответствии с соответствующими институциональными рекомендациями.
7. При желании в качестве контрольной популяции клеток получить активированные CD8⁺ Т-клетки из PBMC пуповинной крови, поместить 10-7 клеток в 5 мл полной среды в колбу для культуры Т25, покрытую смесью анти-CD3 и анти-CD28 антител в концентрации 10 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно.
8. На следующий день извлеките активированные клетки пуповинной крови из колбы, промойте их 1 раз свежей полной средой и размножите клетки в присутствии рекомбинантного IL-2 (100 Ед/мл) в течение 2 недель.
9. Очистите CD8⁺ Т-клетки пуповинной крови методом отрицательной иммуномагнитной сортировки с помощью имеющегося в продаже набора в соответствии с инструкцией производителя. Подсчитайте клетки и замените среду на буфер для анализа, как описано в шагах 1.3–1.6 для LN и PB CD8⁺ Т-клеток.

2. Компоненты для приготовления планарных липидных бислоев

1. Приготовьте 3 вида липосом, как описано в других разделах: (а) 0,4 мМ липосомы DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина), (б) 0,4 мМ липосомы ДОПК, содержащие 33 мол.% DOGS-NTA (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[(N-(5-амино-1-карбоксипентил)иминодиуксусная кислота)сукцинил] (соль аммония)) липиды, (в) 0,4 мМ липосомы ДОПК, содержащие 4 мол.% биотинил-кап-ПЭ (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(кап биотин) (соль натрия)).
2. Приготовьте 5% раствор казеина, как описано ранее.
   1. Растворите 5 г порошка казеина в 100 мл сверхчистой воды и добавьте 350 мкл 10 М гидроксида натрия. Все перемешайте на обычной магнитной мешалке на медленной скорости в соответствии с имеющейся шкалой, при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем на ночь при 4 °C. Отрегулируйте pH до 7,3 и ультрацентрифугируйте раствор в течение 2 ч при 100 000 x g при 4 °C. Отфильтруйте надосадочную жидкость стерильным фильтром 0,22 мкм и храните раствор в аликвотах при температуре -80 °C. <бр/> осторожность: Раствор гидроксида натрия может вызвать химические ожоги и вызвать постоянную слепоту при контакте с глазами. Используйте резиновые перчатки, защитную одежду и средства защиты глаз при работе с этим химическим веществом или его растворами.
3. Мечите анти-CD3 антитела биотином для получения монобиотинилированных молекул антител с помощью ранее описанного подхода.
   1. Приготовьте раствор Биотин-ПЭО4-NHS в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 0,1 мг/мл. Добавьте 3,7 мкл раствора Biotin-PEO4-NHS к 1 мг антитела в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 100 мМ бикарбоната натрия.
   2. Выдержать смесь в течение 2 ч при комнатной температуре. Приготовьте раствор эфира Alexa Fluor 488 NHS в концентрации 10 мг/мл в ДМСО. Добавьте раствор эфира Alexa Fluor 488 NHS к антителу, меченному Biotin-PEO4-NHS, в 10-кратном избытке моляров.
   3. Выдержать смесь в течение 1 ч при комнатной температуре при медленном помешивании на обычной магнитной мешалке. Отделите несвязанный краситель с помощью эксклюзионной хроматографии.
   4. Определите концентрацию антитела, измерив оптическую плотность раствора антитела при длине волны 280 нм (A280). Измерьте оптическую плотность меченых антител на длине волны 577 нм (A577).
   5. Определите соотношение красителя и антител с помощью следующего уравнения:
      
      заметка: Дополнительные сведения можно найти в протоколе производителя.
4. Экспрессируйте рекомбинантно растворимый белок межклеточной молекулы адгезии 1 (ICAM-1) в системе экспрессии дрозофилы, как описано ранее.
   1. Клонировать с кодированием кДНК эктодомен ICAM-1 в вектор экспрессии дрозофилы pMT/V5-His с индуцируемым промотором металлотионеина для получения рекомбинантного белка, дополненного меткой His6 на С-концевом конце.
   2. Котрансфектировать клетки S2 с полученным ICAM-1, содержащим плазмиду и вектор экспрессии генетина (G418). Выберите стабильные трансфектанты с использованием Schneider's Drosophila Media с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) и 0,5 мг/мл G418 в течение 3 недель. Разрастите клетки в бессывороточной среде насекомых и индуцируйте экспрессию белка с помощью 0,5 мМ CuSO₄ в течение 3 дней.
   3. Концентрируйте надосадочную жидкость культуры в 10 раз и проводите диализ против PBS с помощью концентратора тангенциального потока, как описано выше.
   4. Концентрированный надосадочный жидкость культуры нанести на колонку, содержащую сефарозу с ковалентно иммобилизованным моноклональным антителом против ICAM-1 и элюировать связанный ICAM-1 глициновым буфером с концентрацией 50 мМ, pH 3,0. Немедленно нейтрализуйте элюированный белок ICAM-1 с помощью буфера 2 М Трис, pH 8,0.
   5. Диализуйте элюированный материал в соответствии с PBS, pH 8,0 и добавьте диализованный материал в колонку, содержащую агарозу Ni-NTA (никель-нитрилоуксусная кислота). Элюированный растворимый ICAM-1 с 200 мМ имидазолом, pH 8,0. Диализуйте элюированный материал с помощью буфера PBS, pH 8,0.
   6. Маркируйте очищенный ICAM-1 эфиром Cyanine5 N-гидроксисукцинимида (Cy5 NHS) в соответствии с инструкциями производителя.
      заметка: Наилучшее конечное соотношение красителя к белку составляет 1:1.
5. Получение Fab-фрагментов из антитела к CD107a путем расщепления папаина и очистка Fab-фрагментов с помощью ионообменной хроматографии, как описано ранее. Пометьте фрагменты Fab эфиром Alexa Fluor 568 NHS в соответствии с инструкциями производителя.

3. Формирование плоских липидных бислоев на стеклянной основе

1. Приготовьте свежий кислый раствор пираньи, смешав 140 мл концентрированной серной кислоты и 60 мл 30% перекиси водорода. Стеклянные покровные стекла для проточных горок вымыть, замочив их в растворе кислоты пираньи на 30 минут. Удерживайте стеклянный покровный лист полипропиленовыми щипцами ножничного типа.
   осторожность: Раствор пираньи является чрезвычайно сильным окислителем. Не забывайте всегда надевать защитные очки, защитные очки или защитный щиток вместе с толстыми резиновыми перчатками во время работы с раствором. Работать только с раствором пираньи под вытяжным шкафом. Избегайте нагревания, транспортировки или встряхивания его в любое время во время использования, так как он может взорваться. Соберите отходы пираньи в стеклянную бутылку с отверстием, содержащим свинец. Обратитесь в Комитет по безопасности учреждений по вопросам правильной утилизации отходов.
2. Прополощите выстиранные покровные стекла 7 раз сверхчистой водой, последовательно переложив их в стаканы с пресной водой. Отложите влажные покровные стекла в сторону, чтобы остатки воды скатились с чистого стекла, оставив сухое стекло.
   1. В качестве альтернативы используйте наконечник для дозатора, прикрепленный к вакуумному насосу, чтобы осторожно удалить оставшиеся капли воды с покровных стекол.
3. В стерильном капюшоне выполняйте разведение различных липидов для получения липосомной смеси для изготовления бислоев. Сначала соедините 37 мкл липосом DOPC и 3 мкл липосом Biotinyl-Cap-PE. Во-вторых, смешайте 14 мкл липосомов DOPC и 15 мкл липосомов DOGS-NTA. В-третьих, добавьте 1 мкл первой смеси к 29 мкл второй смеси, чтобы получить окончательную смесь липосом.
4. В стерильном капюшоне обустройте рабочее место с сухими покровными стеклами рядом. Внесите 2 мкл готовой смеси липосом (см. шаг 3.3) точно в центр самоклеящегося канала предметного стекла. Немедленно и очень точно совместите чистый и сухой покровный лист с предметным стеклом и осторожно опустите покровное стекло на липкую сторону предметного стекла.
   1. При подготовке более одного предметного стекла работайте над одним предметным стеклом за раз, так как смесь липосом быстро испаряется. Переверните предметное стекло и с помощью наружного кольца полипропиленовых щипцов ножничного типа слегка надавите на периферический контакт покровного стекла с предметным стеклом, убедившись, что оно плотно прикреплено к предметному стеклу во избежание утечки.
      заметка: Не прижимайте к каналам затвора, чтобы не сломать или не растрескать покровное стекло.
   2. Снова переверните предметное стекло и отметьте положение сформированного бислоя, который выглядит как капля между покровным стеклом и канальным слайдом, нарисовав 4 точки постоянным маркером вокруг бислоя на внешней стороне слайда сборки.
5. Перед первым впрыском жидкости в канал обозначьте один порт канала как входной порт, а другой — как выходной порт и сохраняйте это обозначение на протяжении всего эксперимента.
6. Во избежание образования пузырьков вставьте конец наконечника пипетки непосредственно во входное отверстие канала. Медленно заполните каналы предметного стекла 50 мкл теплого (не менее комнатной температуры) буфера для анализа (см. шаг 1.5 для буферного состава).
7. Приготовьте 0,5 М раствор хлорида никеля(II). Разморозьте 2 мл раствора казеина на водяной бане при 37 °С в течение 30 мин и дополните его раствором хлорида никеля в конечной концентрации 200 мкМ.
8. Промойте бислои, сначала введя 100 мкл раствора казеина во входной порт канала, а затем немедленно удалив 100 мкл из выходного порта на предметном стекле с помощью пипетирования. Заблокируйте бислои тем же раствором, введя 100 мкл раствора казеина во входное отверстие каждого канала и инкубируя предметное стекло в течение 45 минут при комнатной температуре.
9. Разморозьте аликвоты белков Cy5-ICAM-1-His₆ и стрептавидина. Соедините белки в буфере для анализа с конечной концентрацией 2 мкг/мл каждый. Центрифугируйте раствор в течение 30 минут при 20 000 x g и 4 °C для удаления любых заполнителей.
10. Удалите остатки блокирующего раствора из выходного отверстия канала предметного стекла с помощью пипетирования. Введите 100 мкл раствора, содержащего ICAM-1 и стрептавидин, во входной порт.
11. Выдержать предметное стекло в течение 45 минут при комнатной температуре. Удалите излишки белкового раствора из выходного отверстия. Промойте бислой 2 раза, сначала введя 100 мкл буфера для анализа во входной порт канала, а затем немедленно удалив 100 мкл из выходного порта.
12. Разбавьте меченное Alexa-Fluor-488 анти-CD3 антитело с буфером для анализа до конечной концентрации 2 мкг/мл. Введите 100 мкл раствора антитела во входной порт предметного стекла и инкубируйте его в течение 45 мин при комнатной температуре. Удалите излишки белкового раствора из выходного отверстия. Промойте бислой 2x 100 мкл буфера для анализа, как показано в шаге 3.11.

4. Визуализация взаимодействия Т-клеток с планарным бислоем

1. Предварительно нагрейте предметный столик и объектив конфокального микроскопа или микроскопа с полным внутренним отражением (TIRF) до тех пор, пока температура не уравновесится на уровне 37 °C. Установите предметное стекло с бислоем (слоями) на нагреваемый предметный стол. Переместите предметный столик в нужное положение в соответствии с чернильными метками и сосредоточьтесь на бислое, используя флуоресценцию молекул ICAM-1, меченных Cy.
   1. Используйте объектив 61X для конфокального микроскопа или объектив 100X для микроскопа TIRF с соответствующими настройками фильтра.
2. Для визуализации высвобождения гранул с помощью микроскопии TIRF добавьте меченые Alexa-Fluor-568 фрагменты антитела против CD107a Fab в клеточную суспензию в конечной концентрации 4 мкг/мл перед введением клеток во входные порты.
   1. Ресуспендируйте полученные CD4⁺ Т-клетки, выделенные из LN PB или пуповинной крови, и введите 50 мкл клеточной суспензии во входной порт слайдового канала, содержащего бислой.
3. Выберите желаемое количество полей и записывайте изображения каждого поля 1 раз в 2 минуты в течение 30 минут после инъекции.
4. Используйте светлопольные, отраженные и флуоресцентные каналы (Alexa 488 и Cy5) конфокального микроскопа для получения изображений. Используйте режим TIRF для флуоресценции Alexa-Fluor-488 и Alexa-Fluor-568 и широкоугольный режим для флуоресценции Cy5, а также для визуализации в светлом поле на микроскопе TIRF.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для выделения CD4 Т-клеток, человек	Милтенил Биотек	Тел.: 130-096-533
Набор для выделения CD8 Т-клеток, человек	Милтенил Биотек	Тел.: 130-096-495
ДОПК	Avanti Polar Lipids	850375К
СОБАКИ NTA	Avanti Polar Lipids	790528С
Биотиниловый колпачок ПЭ	Avanti Polar Lipids	870273С
Сывороточный альбумин человека	Октафарма США	НДЦ 68982-643-01
Липкий слайд VI 0.4	Там же	80608
Покровные стекла для липких горок	Там же	No 10812
Камера Bioptech FCS2	Биоптех	060319-2-03
антитела к CD3	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 16-0037-81	Клон OKT3, гибридомные клетки доступны в ATCC
антитела к CD28	Генетекс	GTX14664	Клон 9.3
казеин	сигма	С5890
Биотин-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	No 21329
Дмсо	сигма	Д2650-5
Набор для мечения белка Alexa Fluor 488 с колонкой для очистки меченых белков	Thermo Fisher Scientific	А10235
Набор для мечения белка Alexa Fluor 568 с колонкой для очистки меченых белков	Thermo Fisher Scientific	А10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Медико-биологические науки	PA15101
pMT/V5-HIS векторы экспрессии дрозофил A, B, C	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Вектор экспрессии дрозофил для положительного отбора	АТКС	No 37409
Дрософиальный медиа без сыворотки Insect-XPRESS	Лонза	12-730В
Гибридома YN1/1.7.4	АТКС	CRL1878	Гибридома выделяет антитела против ICAM-1.
Цианоген-активируемый бромид-сефароза 4B	Сигма-Олдрич	С9142	Используется для получения сефарозы с равномерно связанным анти-ICAM антителом.
Концентратор тангенциального потока MasterFlex	Коул-Пармер	77601-60 7592-40	Используется для концентрации надосадочной жидкости, содержащей ICAM-1, и диализа ICAM-1, содержащего супернант
Системы тангенциального потока Centramate Lab	Лаборатория Пэлла	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Используется для концентрации надосадочной жидкости, содержащей ICAM-1, и диализа ICAM-1, содержащего супернант
Ni-NTA Агароза	ЦИАГЕН	30210 (Английский
Диализные трубки	Спектра/Пор	131384
Папаин из папайи латекс	сигма	П3125
мышиное антитело к человеку против CD107a	BD Bioscences	555798	Клон H4A3
Перчатки Ansell натурального синего цвета	Научный центр Фишера	Тел.: 19-014-539
Nalgene Полипропиленовые щипцы ножничного типа	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Стрептавидин	ProZyme	СА10
Конфокальный микроскоп	Компания Nikon		Инвертированный микроскоп Nikon TiE, оснащенный PFS для долгосрочного контроля стабильности изображения, 60-кратным масляным объективом, 4 лазерами с линиями возбуждения на 405, 458, 488, 514, 561 и 640 нм, 2 детектора GaAsP и 2 высокочувствительными ФЭУ, проходящим светом DIC, программируемым столиком X, Y, Z для нескольких положений и сшивания больших площадей, функциями замедленной съемки, Камера Tokai-Hit с контролем температуры и CO2 для визуализации в реальном времени, а также антивибрационный изолирующий стол
Микроскоп TIRF	Андор		Система Andor Revolution XD оснащена осветителем Nikon TIRF-E, лазерами с 405, 488, 561 и 640 линиями, проходящим светом DIC, вращающейся дисковой головкой Yokogawa CSU-X1 для конфокальной визуализации, объективом 100/1.49 NA, камерой Andor iXon X3 EM-CCD, нагревателем объектива и пьезоэлектрическим моторизованным столиком с системой идеальной фокусировки (PFS)