Влияние иммуномодулирующего фармакологического средства на взаимодействие дендритных клеток с CD4+ Т-клетками

Аннотация

Источник: Wei, H., et al. Развитие и функциональная характеристика толерогенных дендритных клеток мышей. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Это видео демонстрирует метод преобразования дендритных клеток (ДК) в толерогенные ДК (TolDC) с использованием иммуномодулирующего фармакологического агента. Эта конверсия подтверждается оценкой функции TolDC через их иммуносупрессивное действие на CD4+ Т-клетки.

Протокол

1. Оценка функции TolDCs in vitro и in vivo

1. Анализ сингенной пролиферации Т-клеток
   1. Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью автоклавирования и проведите эксперимент в шкафу биологической безопасности класса II с соответствующими процедурами безопасности.
   2. Приготовьте буфер MACS с использованием 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА в 500 мл PBS. Стерилизовать буфер путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
      заметка: Держите буфер на льду во время следующего эксперимента.
   3. Для получения CD4+ Т-клеток усыпляют трансгенных мышей с рецептором Т-клеток OT-II (TCR) в возрасте 8-10 недель с помощью камеры_CO-2. Поместите мышь на доску для препарирования и промойте 70% этанолом. Изолируйте селезенку от левой стороны брюшной полости с помощью хирургических ножниц и щипцов.
   4. Поместите селезенку с 2 мл PBS в чашку для культивирования 6 см и используйте заднюю часть палочки шприца объемом 3 мл, чтобы измельчить селезенку, пропустив через клеточное ситечко 40 мкм.
   5. Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
   6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл буфера MACS.
   7. Добавьте 100 мкл биотина-антителового коктейля CD4+ T-клеток при температуре 4°C в течение 5 мин.
      заметка: Коктейль антител связывается с другими типами клеток, кроме CD4+ Т-клеток, такими как CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC класса II, Ter-119 и TCRγ/δ.
   8. Добавьте 300 μл буфера MACS и 200 μл гранул антибиотина (Таблица материалов) при температуре 4°C в течение 10 минут.
   9. Поместите колонку, состоящую из ферромагнитных сфер (Таблица материалов) и фильтр предварительной сепарации, в магнитное поле и промойте ее 3 мл буфера MACS.
   10. Добавьте 9 мл буфера MACS в ячейки и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
   11. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 3 мл буфера MACS и нанесите его на колонку. Соберите проточные CD4+ Т-клетки.
   12. Промойте колонку еще 3 мл буфера MACS и также соберите проточный поток.
   13. Для получения ДК селезеночной сковороды усыпляют мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель с помощью камеры с_СО2. Поместите мышь на доску для препарирования и промойте 70% этанолом. Изолируйте селезенку от левой стороны брюшной полости с помощью хирургических ножниц и щипцов. Поместите селезенку в 6-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую 2 мл раствора коллагеназы D (2 мг/мл коллагеназы D, растворенной в HBSS, содержащем кальций и магний).
   14. Введите 1 мл раствора коллагеназы D в селезенку два раза с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 25G. Разрежьте селезенку на небольшие кусочки маленькими ножницами.
   15. Встряхните и выдержите при комнатной температуре в течение 25 минут.
   16. Добавьте 500 μл 0,5 М ЭДТА при комнатной температуре в течение 5 мин.<бр/> заметка: Шаги из 1.1.13-1.1.14 имеют решающее значение для увеличения производительности DC.
   17. Теперь используйте заднюю часть палочки шприца объемом 3 мл, чтобы измельчить суспензию селезенки, пропустив через клеточное сетчатое фильтр размером 40 мкм, и соберите клеточную суспензию, центрифугируя при 300 x g в течение 5 минут.
   18. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 350 мкл буфера MACS, 50 мкл блокирующего реагента FcR и 100 мкл биотин-антителенного коктейля Pan Dendritic Cell при 4°C в течение 10 мин.
       заметка: Коктейль антител против антигенов, которые не экспрессируются ДК.
   19. Промойте клетки, добавив 9 мл буфера MACS, и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут.
   20. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 800 мкл буфера MACS и добавьте 200 мкл гранул антибиотина при 4°C на 10 минут.
   21. Повторите шаги из 1.1.9-1.1.11 для сбора DC.
   22. Промойте колонку еще 3 мл буфера MACS два раза и также соберите проточный.
   23. Обрабатывайте 2 x 10⁵ DCs/мл в присутствии или отсутствии 100-400 нМ CDDO-dfpa при 37°C в течение 1 ч. Отдельно пометьте CD4+ Т-клетки (1 x 10⁷/мл) 1 мкМ CFSE при 37°C в течение 15 минут, промойте PBS и отрегулируйте объем, чтобы получить конечную концентрацию 2 x 10⁶ Т-клеток/мл.
   24. Затем в 96-луночном планшете совместно культивируют 100 мкл обработанных дендритных клеток с таким же объемом меченых CFSE CD4+ Т-клеток, собранных на описанных выше стадиях, чтобы получить соотношение 1:10. Теперь добавьте пептид овальбумина (OVA) 323-329 с концентрацией 100 нг/мл в лунку и измерьте интенсивность CFSE Т-клеток с помощью проточной цитометрии после 2-3 дней инкубации.
       заметка: Количество клеток и соотношение ДК и Т-клеток были оптимизированы по сравнению с нашей предыдущей работой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CDDO-DFPA (RTA-408)	Реата Фармасьютикалз	Собственный синтез	Культура клеток
Мышь GM-CSF	Пепротех Инк	315-03	Дифференциация BMDC
Набор для выделения пан-дендритных клеток	Miltenyi Biotec Inc.	Тел.: 130-100-875	Анализ пролиферации Т-клеток
Коктейль из биотина и антител Pan Dendritic Cell	Miltenyi Biotec Inc.	Тел.: 130-100-875	Анализ пролиферации Т-клеток
Комплект для выделения CD4+ Т-клеток	Милтеньи Биотек Инк	Тел.: 130-104-454	Анализ пролиферации Т-клеток
CFSE	Биолегенда	423801	Анализ пролиферации Т-клеток
Блокирующий реагент FcR	Miltenyi Biotec Inc.	Тел.: 130-100-875	Анализ пролиферации Т-клеток
Антибиотиновые микрошарики	Miltenyi Biotec Inc.	Тел.: 130-104-454	Анализ пролиферации Т-клеток
1 мл шприц	BD Biosciences	309626	Анализ пролиферации Т-клеток
БСА	Сигма Олдрич Инк	А2058	Анализ пролиферации Т-клеток
Эдта	ThermoFisher Scientific	15575020	Анализ пролиферации Т-клеток
Колонна LS	Miltenyi Biotec Inc.	Тел.: 130-042-401	Анализ пролиферации Т-клеток
Фильтр предварительной сепарации	Милтеньи Биотек Инк	Тел.: 130-095-823	Анализ пролиферации Т-клеток
Коллагеназа D	Сигма Олдрич Инк.	11088858001	Анализ пролиферации Т-клеток
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	Анализ пролиферации Т-клеток
Пептид овальбумина (ОВА) 323–329	Сигма Олдрич Инк.	О1641	Анализ пролиферации Т-клеток