Метод in vitro для визуализации экзоцитоза секреторных гранул в тучных клетках

Аннотация

Источник: Кляйн, О., и др. Визуализация FITC-декстрана в качестве репортера для регулируемого экзоцитоза J. vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику визуализации экзоцитоза в тучных клетках. Клетки инкубируются с FITC-декстраном — флуоресцентным репортером, который поглощается клетками внутри секреторных гранул (SG), где кислый pH гасит свою флуоресценцию. При стимуляции гранулярного экзоцитоза более высокий pH среды индуцирует флуоресценцию репортера внутри слитых SGs, которая визуализируется с помощью флуоресцентного микроскопа.

Протокол

1. Подготовка

1. Приготовление питательных сред RBL (RBL-2H3 тучной клеточной линии)
   1. Смешайте 500 мл модифицированной среды Дульбекко с низким содержанием глюкозы (DMEM) с 56 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5,5 мл раствора пенициллин-стрептомицина-нистатина, 5,5 мл раствора L-глутамина 200 мМ. Это приводит к низкому уровню глюкозы в ДМЭМ, дополненному 10% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина, 12 ЕД/мл нистатина и 2 мМ L-глютамина.
   2. Фильтруйте фильтрующий материал с помощью верхнего вакуумного фильтра с размером пор 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C.
2. Обслуживание ячеек RBL.
   1. Выращивайте клетки RBL до максимальной конфлюенции 90% в чашке длиной 10 см. Если клеточная культура здорова, клетки должны иметь веретенообразную форму с редкими выступами.
   2. Для расщепления клеток отделите клетки от чашки, аспирировав среду и заменив ее 2 мл раствора трипсина/ЭДТА В. Инкубируйте в течение 5-10 минут во влажной атмосфере с содержанием 5%_СО2 при 37 °С.
   3. После того, как клетки отделятся, нейтрализуйте трипсин, добавив 2 мл питательной среды с помощью пипетки, и разделите клетки в соотношении 1:2 - 1:10.
3. Приготовление 20-кратного буфера Tyrode's
   1. Приготовьте исходный 20-кратный раствор 54 мМ KCl, 20 мМ MgCl₂, 2,74 М NaCl и 8 мМ₂PO₄ в воде двойной дистилляции (DDW). Хорошо перемешайте и храните при температуре 4 °C.

2. Культура RBL-клеток для микроскопии живых клеток

1. Приготовление раствора ФИТК-декстрана.
   1. Смешайте 1 мг порошка флюоресцеина изотиоцианата (ФИТК)-декстрана (150 К) на 1 мл питательной среды (см. шаг 1.1.1). Для полнокамерного покровного стекла подготовьте 3 мл.
   2. С помощью шприцевого фильтрующего устройства из ацетата целлюлозы с размером пор 0,22 мкм отфильтруйте растворенный ФИТК-декстран.
   3. Добавьте мышиный иммуноглобулин Е (IgE) в концентрации 1 мкг/мл.
2. Посев RBL-клеток для визуализации
   1. За день до визуализации аспирируйте среду из чашки для культивирования и замените ее 2 мл раствора трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) В. Инкубируйте в течение 5 - 10 минут во влажной атмосфере с содержанием 5%_СО2 при 37 °С. После того, как клетки отделятся, нейтрализуйте трипсин, добавив 2 мл питательной среды.
   2. Подсчитайте RBL-клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте объем соответственно с помощью питательных сред, чтобы получить концентрацию клеток 7,5 x 10⁵/мл.
   3. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии в камерное покровное стекло, предварительно заполненное свежей питательной средой с добавлением ФИТК-декстрана (в результате получается посев 7,5 х 10³ клеток в камере).
   4. Выращивайте клетки RBL в течение ночи в увлажненной атмосфере 5%_CO2 при 37 °C. Клетки должны оставаться на субконфлюентном уровне, чтобы убедиться, что клетки разделены и что каждую клетку легко идентифицировать по отдельности под микроскопом.
3. Трансфекция RBL клеток - по желанию.
   1. Для визуализации экзоцитарных событий в сочетании с другими флуоресцентно мечеными белками см. протокол трансфекции для клеток RBL в Azouz et al.

3. Живая клеточная микроскопия экзоцитоза

1. Приготовление растворов:
   1. Приготовьте окончательный буферный раствор Тироде путем разведения исходного раствора в DDW в соотношении 1:20 и добавьте 20 мМ Hepes pH 7, 1,8 мМ CaCl₂, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 5,6 мМ глюкозы.
   2. Свежеприготовьте реактив с 20-кратным секретагогом в буфере Тайроде [1 мкг/мл динитрофенил, конъюгированный с сывороточным альбумином человека (DNP-HAS (Ag)) в нашем случае, в концентрации 50 нг/мл 1x].
   3. Приготовьте 400 мМ раствор хлорида аммония, растворив порошок в буфере Tyrode.
2. Подготовка клеток.
   1. Защитное стекло камеры промыть 3 раза, отсасывая среду из камеры и повторно наполнив ее 300 мкл буфера Tyrode, предварительно подогретого до 37 °C. Наконец, пополните камеру 300 мкл буфера Tyrode, предварительно подогретого до 37 °C.
   2. Поместите камерное покровное стекло в камеру инкубатора микроскопа. Убедитесь, что камера устойчива.
3. Настройка микроскопа
   1. Чтобы выбрать интересующую область для отслеживания, включите источник флуоресцентного света (традиционно ртутную лампу) и выберите подходящий флуоресцентный фильтр (выберите фильтр для зеленых флуорофоров для просмотра FITC-декстрана). Как только интересующая область окажется в фокусе и в центре поля зрения, выключите источник света, чтобы избежать фотообесцвечивания и токсичности.
      Примечание: Некоторое количество ФИТК-декстрана, включенного в клетки, может сохранять флуоресценцию. Это связано с тем, что FITC-декстран также может быть отсортирован по нелизосомным компартментам, таким как эндосомы.
   2. Включите соответствующее освещение для возбуждения FITC. Если вы используете лазерный микроскоп, включите лазер с длиной волны 488 нм. Излучение должно быть собрано в районе 500 - 550 нм (пик излучения FITC на 510 - 520 нм).
   3. При использовании конфокального микроскопа откройте отверстие на максимум. Это позволит использовать более низкую мощность лазера, чтобы избежать обесцвечивания и токсичности, а также обеспечит захват событий экзоцитоза со всех плоскостей клетки.
   4. Калибровка временного интервала между получением изображений.
      1. Разные клетки могут различаться по кинетике регулируемого экзоцитоза. Для специфической визуализации сложного экзоцитоза мы рекомендуем интервал времени не менее 5 секунд. Однако, как правило, чтобы обеспечить быструю визуализацию, убедитесь, что время получения одного кадра короткое.
      2. При использовании лазерно-сканирующего конфокального микроскопа установите направление сканирования двунаправленным, не допускайте усреднения, а разрешение установите на уровне 512 x 512 (рекомендуется; последние два положения также помогут свести к минимуму обесцвечивание и токсичность).
4. Визуализация экзоцитоза.
   1. Визуализируйте клетки для желаемой длительности, в зависимости от типа клетки или секретагога. В клетках RBL, вызванных IgE/Ag, большинство экзоцитарных событий происходит в течение 15-20 минут после активации.
   2. Для активации клеток добавьте в камеру 16 мкл из 20-кратного раствора секретагога.
5. Подтверждение наличия ФИТК-декстрана в клетках.
   1. Чтобы подтвердить наличие и локализацию ФИТК-декстрана в СГ, добавьте в камеру 16 мкл раствора хлорида аммония (будьте осторожны, не двигайте камеру, чтобы не потерять фокус) (это даст конечную концентрацию 20 мМ). Это вызовет подщелачивание SG и ослабление флуоресценции FITC, что произойдет в течение нескольких секунд.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM с низким уровнем глюкозы	Биологические индукционные установки	01-050-1А
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	No 12657
Раствор пен-стрептококка-нистатина	Биологические индукционные установки	03-032-1Б
L-глютамин 200 мМ раствор	Биологические индукционные установки	03-020-1А
FITC dextran 150K	Сигма-Олдрич	46946-500МГ-Ф
Трипсин/ЭДТА раствор B	Биологические индукционные установки	03-052-1А	Перед использованием подогреть на водяной бане при температуре 37 °C
Верхневакуумный фильтр с размером пор 0,22 мкм	Сигма-Олдрич	CLS430769-1 шт.
Фильтрующий блок для шприцев из ацетата целлюлозы, размер пор 0,22 мкм	Сарториус	16534К
Камерное покровное стекло	Термонаучная	155411
Чашки для культивирования тканей, обработанных культурой Corning	Сигма-Олдрич	CLS430167
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А4503
Анти-ДНФ моноклональный IgE	Сигма-Олдрич	Д8406
DNP-HSA (Ag)	Сигма-Олдрич	А6661	Избегайте прямого воздействия света
Буфер Hepes 1M, pH 7,4	Биологические индукционные установки	03-025-1Б
CaCl2	МЕРК	102382
глюкоза	Лаборатории BDH	284515В
нашатырь	МЕРК	1145
ТРУБЫ дикалийная соль	Сигма-Олдрич	108321-27-3 (Английский)
Гидрат ацетата кальция	Сигма-Олдрич	114460-21-8
Тетрагидрат ацетата магния	Сигма-Олдрич	М5661
Глутамат калия (L-глутаминовая кислота, моногидрат соли калия)	Сигма-Олдрич	Г1501
2PO4	МЕРК	Номер 6346
NaCl	МЕРК	106404
MgCl2	МЕРК	105833
KCl	МЕРК	104936
Электропоратор	БТХ	ЭСМ830
Конфокальный микроскоп, Zeiss	Цейсс	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Использовано на рисунке 3. Оснащен электронным регулятором температуры
Инкубатор AirStream
Конфокальный микроскоп, Zeiss	Цейсс	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Использовано на рисунке 2. Оснащен детектором GaAsP с электронным контролем температуры
Инкубатор AirStream
Конфокальный микроскоп, Leica	Лейка	СП5	Использовано на рисунке 1. Оснащен детектором Leica HyD и инкубатором верхней ступени (околаб)
Элементы RBL-2H3			Клетки RBL-2H3 были клонированы в лаборатории Рубена. Сираганяна. Смотрите ссылку 67

г.