$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Конъюгация белкового антигена с ПЭГилированным липидом
- Добавьте 3 г сшитых гелевых гранул декстрана с диапазоном фракционирования 1 500–30 000 дальтон (Да) в вакуумную колбу объемом 250 мл. Добавьте 60 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и постоянно перемешивайте с помощью магнитной мешалки. Запечатайте колбу и прикрепите ее к вакууму, чтобы начать дегазацию на мешалке в течение минимум 1 часа.
- В стеклянную хроматографическую колонку размером 1,0 см х 30 см с закрытой пробкой оборота добавьте PBS в колонку для промывки. Откройте стопор оборота и слейте воду из колонны. После промывки добавьте в столбик кашицу из дегазированных шариков. Постоянно добавляйте суспензию до тех пор, пока колонна не уплотнится до высоты валика примерно 24 см.
- После того, как колонна достигнет «головы» примерно на 4–5 см PBS над упакованными бусинами, подготовьте следующие шаги.
- Создайте сифон гравитационного потока, измерив кусок трубки достаточно длинной, чтобы достичь полки на высоте 1–2 фута над вершиной колонны, и создайте петлю, которая опускается у основания колонны и возвращается к вершине колонны. Добавьте пробку для оборота на один конец трубки, оставив одну сторону трубки открытой. Поместите открытый конец пробирки в бутылку PBS объемом 500 мл и поставьте ее на полку над колонкой.
- Возьмите конец с ограничителем оборота и присоедините шприц объемом 10 мл. Откройте стопорный клапан оборота на линии трубки и пропустите PBS через трубку. Как только PBS достигнет трех четвертей пути через трубку, быстро извлеките шприц и добавьте пробку оборота в верхнюю часть колонны — жидкость должна стекать на колонну.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество «головы» PBS, оставшегося в верхней части колонки, должно составлять от 1 до 3 см. Минимальное количество для промывки колонны составляет 3 объема колонны.
- Определение количества белка (молей), которое должно быть связано с липидами, на основе его молекулярной массы (МВт).
Примечание: Fab-фрагмент козьего антимышиного иммуноглобулина, IgM (который сам по себе является IgG) используется здесь в качестве универсального суррогатного антигена для поликлональной стимуляции В-клеток. Соответственно, Fab-фрагмент козьего IgG имеет МВт примерно 48 килодальтон (кДа) и коммерчески доступен в общем количестве 1,3 мг. Таким образом, количество связываемого белка составляет 27,1 мкмоль.
- Определите коэффициент угасания интересующего белка. Если неизвестно, измерьте поглощение белка при длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра и разделите значение A280 на количество моль, рассчитанное на шаге 1.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент экстинкции Fab козьего IgG при длине волны 280 нм составляет 64 600 М-1.
- Чтобы обеспечить удаление следовых количеств аминосодержащего буфера, обессолите белок на колонке, созданной на этапах 1.1–1.3, и соберите белковые фракции в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (~500 мкл на фракцию).
- Закройте стопорный клапан оборота, соединенный с верхней частью колонны, и снимите верхнюю часть колонны. Если он еще не открыт, откройте стопорный клапан оборота в нижней части колонны и подождите, пока «головка» PBS не коснется верхней части валиков.
- Медленно добавляйте интересующий вас белок в верхнюю часть бусин с помощью стеклянной пастеровской пипетки, стараясь свести к минимуму повреждение верхней части бусин.
- Как только «головка» белкового раствора достигнет верхней части шариков, осторожно добавьте 1 мл PBS с помощью пастеровской пипетки. Повторите три раза. Добавьте PBS для создания головы 4–5 см и повторите шаг 1.3 для мытья колонны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно пропустить, если нет уверенности в отсутствии аминосодержащего буфера.
- Определите фракции, содержащие белок, измерив значения A280, и объедините фракции, которые дают примерно 90% восстановления белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это разбавляет белок в 1,5-2 раза. Определите концентрацию белка после объединения. Сконцентрируйте белок на этом этапе, при необходимости, с помощью центрифугирующего концентратора.
- Добавьте к белку 2,5 молярного эквивалента гетеробифункционального сшивающего агента.
- Сначала внесите приблизительно 5 мг сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP, MW = 314 г/моль) в микроцентрифужную пробирку. Для определения объема растворения SPDP необходимо увеличить концентрацию молярного белка и в 250 раз получить 100-кратный раствор, который даст 2,5 молярного избытка в реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если концентрация белка составляет 50 мкМ, необходим раствор SPDP в концентрации 12,5 мМ. Для 5 мг SPDP это соответствует 1,27 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Добавьте SPDP к интересующему белку в разведении 1:100. Поместите реакцию на осциллирующий шейкер при комнатной температуре (RT) примерно на 1 ч.
- Для удаления избытка SPDP и защиты эндогенных дисульфидных связей в белке на последующей стадии восстановления уравновесьте и промойте колонку, созданную на этапах 1.1–1,3, в 100 мМ ацетата натрия (NaOAc) при pH 5,5 или создайте идентичную колонку исключительно для использования в этом буфере.
- После 1 ч инкубации с SPDP обессолить белок на колонке, уравновешенный в 100 мМ NaOAc. Выполните этот этап так же, как и на шаге 1.6, за исключением использования 100 мМ NaOAc (pH 5,5) в качестве элюента. Соберите дроби, определите A280 и объедините верхние фракции. Вымойте колонку в PBS.
- Приготовьте раствор 2,5 М DTT (MW = 154 г/моль) в воде двойной дистилляции (ddH2O). Добавьте 25 mM DTT к объединенным фракциям белка на 5-10 минут.
- Измерьте A280 белка и разделите его на коэффициент экстинкции. Кроме того, определите A343. Рассчитайте коэффициент связывания на основе молярности белка (A280) и линкера (A343).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отключите автоматическую калибровку A340 при использовании нанокапельного спектрофотометра. Измерение A343 представляет собой поглощение пиридиновой 2-тионовой группы (коэффициент экстинкции = 7550 М-1), которая удаляется из сшивающего агента SPDP с помощью DTT. Молярное соотношение линкер: белок 1,2–1,5 обычно достигается при проведении реакции с 2,5-молярным избытком SDPD на широком спектре белков.
- Прогоните объединенные дроби над столбцом, промытым в PBS, как описано выше. Соберите дроби, определите A280 и соберите верхние фракции. Определяют концентрацию белка по А280 после объединения фракций.
- Приготовьте DSPE-PEG(2000)-малеимид (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000)-малеимид. Он будет добавлен к белку в соотношении моляров 10:1. Приготовьте 100-кратный запас DSPE-PEG(2000)-малеимида для достижения желаемой концентрации.
- Например, если концентрация белка составляет 10 мкМ после стадии 1.14, приготовьте запас DSPE-PEG(2000)-малеимида в дозе 10 мМ. Тщательно взвесьте DSPE-PEG(2000)-малеимид (MW = 3000 г/моль) и добавьте соответствующее количество ДМСО. Несколько раундов мягкого вортексинга и ультразвуковой обработки могут привести к его полному растворению.
- Определите общий объем фракций с шага 1.14 и осторожно перелейте раствор в небольшую (10-25 мл) колбу с круглым дном (RBF). Добавьте соответствующее количество 100-кратного DSPE-PEG(2000)-малеимида к белку для достижения конечной концентрации 1-кратного 10-кратного молярного избытка. Аккуратно взболтайте раствор, чтобы убедиться, что ДМСО полностью диспергирован.
- Проведите реакцию в течение ночи под азотом в герметичной RBF. Используйте резиновую перегородку и поместите ее в вытяжной шкаф.
- Удалите атмосферу, проколов перегородку иглой 20 G, прикрепленной к шприцу объемом 3 мл на конце трубки, прикрепленной к вакууму, и включите вакуум на 3–5 с.
- Замените атмосферу азотом. Наполните баллон, прикрепленный к разрезанному пополам шприцу объемом 3 мл, азотом и прикрепите к нему иглу массой 20 г. Проколите перегородку, чтобы наполнить атмосферу внутри круглой донной колбы азотом. Повторите удаление атмосферы и замену азотом еще раз и оставьте азотный баллон прикрепленным на ночь.
- Приготовьте отдельную колонку из сшитых гелевых шариков декстрана с диапазоном фракционирования 4 000–150 000 Да в стеклянной хроматографической колонке размером 1,0 см x 50 см (в соответствии с шагами 1.1–1.3).
- На следующий день удалите белок из колбы с круглым дном, приготовленной на шаге 1.17, и проведите (следуя методу, использованному в шаге 1.6) по столбцу из сшитых гелевых шариков декстрана (из шага 1.18).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество для загрузки на колонку должно быть не более 2 мл. Если использовалась более крупная реакция, разделите ее на две части и запустите на отдельной колонке или запустите на колонке большего диаметра.
- Соберите фракции, определите A280, фракции в бассейне и определите концентрацию белка. Наличие липида не повлияет на измерения.
- Храните конечные объединенные фракции связанного с липидами белка при температуре 4 °C до готовности к использованию.
2. Получение липосом
- Взвесьте липиды: DSPE-PEG(2000) (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000, MW = 2805,5 г/моль; холестерин (3b-гидрокси-5-холестен, 5-холестен-3b-ол), MW = 386,7 г/моль; и DSPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин), MW = 790,1 г/моль. Создайте раствор DSPC в концентрации 5 мг/мл, раствор холестерина в дозе 4 мг/мл и раствор DSPE-PEG (2000) в концентрации 2 мг/мл в хлороформе.
- Убедитесь, что молярное соотношение липидов в липосомах составляет: 57% DSPC, 38% холестерина и 5% DSPE-PEG (2000), как показано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно контролировать количество антигена на липосоме, которое обычно колеблется в пределах 0,01–0,1%. В таблице 1 использовано 0,1% фрагмента IgM Fab коз против мышей, связанного с ПЭГилированным липидом. Крайне важно учитывать 10-кратный молярный избыток DSPE-PEG(2000)-малеимида, который был добавлен в белок на этапе 1.15, чтобы гарантировать, что общее количество PEGилированного липида не превышает 5%.
- Учитывайте конечное количество липидов (моль) при создании липидов для экструзии. В таблице 1 приведен пример расчета молярных концентраций липидов для создания липосом при общей концентрации липидов 1,25 мкМ.
- После того, как будет рассчитано правильное количество каждого липида, который должен быть добавлен, объедините все в пробирку из боросиликатного стекла объемом 12 мл.
- Осторожно сдуйте хлороформ.
- С помощью трубки и шприца объемом 3 мл с иглой, подготовленного на шаге 1.17.1, осторожно сдуйте хлороформ в пробирке с азотом. Осторожно выдуйте струю азота на раствор, одновременно вращая трубку другой рукой. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму разбрызгивание или попадание жидкости вверх по боковой стороне трубки, так как на следующем этапе может быть сложнее ввести ее в раствор.
- Добавьте 100 мкл ДМСО в каждую пробирку и лиофилизируйте этот раствор в течение ночи. Накройте верхнюю часть пробирки нестатической лабораторной салфеткой, закрепите ее резинкой и заморозьте при температуре -80 °C.
3. Экструзия липосом
- Добавьте 1 мл PBS, содержащего липид-связанный белок, в 12 мл пробирки, содержащей липиды. Ультразвуком наносите раствор в течение примерно от 30 секунд до 1 минуты на ультразвуковой водяной бане. Отдыхайте 5 минут или дольше между каждым раундом и повторите 3–4 раза.
- Подготовьте экструдер в соответствии с указаниями производителя.
- Добавьте опоры фильтра к внутренней мембранной опоре и нанесите несколько капель (по 10 мкл каждая) PBS на парафиновую пленку. С помощью пинцета возьмитесь за край опоры фильтра и окуните его в каплю объемом 10 мкл.
- Поместите фильтр внутрь уплотнительного кольца. Делайте это для обеих сторон. С помощью пинцета возьмите фильтр 0,8 мкм по краю, окуните его в каплю объемом 10 мкл и покройте внешнюю сторону уплотнительного кольца PBS. Аккуратно поместите фильтр 0,8 μм на уплотнительное кольцо, чтобы фильтр не нависал над внутренней мембранной опорой.
- Поместите нагревательный блок экструдера на горячую плиту, чтобы предварительно нагреть экструдер. Включите конфорку на низкий уровень и дайте нагревательному блоку экструдера достичь желаемой температуры. Во избежание возможных проблем с агрегацией белка не нагревайте блок выше 37 °C.
- Загрузите обработанный ультразвуком образец в один из экструзионных шприцев, помещенных в экструдер. Поместите шприц экструдера в другой конец экструдера. Убедитесь, что поршень пустого шприца установлен на ноль. Пустой шприц будет заполняться по мере того, как липид будет выдавлен через мембрану из поликарбоната толщиной 0,8 мкм. Старайтесь избегать пропускания пузырьков вперед и назад через мембрану.
- Поместите полностью собранный экструдер в нагревательный блок. Аккуратно надавите на поршень наполненного шприца с липидами к пустому шприцу. В зависимости от концентрации липидов, это будет трудно протолкнуть. Повторите 20 раз.
- Снимите полностью собранный экструдер с нагревательного блока. Медленно извлеките наполненный шприц из экструдера, обязательно соберите все липиды, которые могут вытечь при удалении. Поместите липосомы в чистый флакон. Повторите шаги 3.4–3.6 с использованием поликарбонатных мембран 0,2 мкм и 0,1 мкм.
- Создайте колонну из агарозных шариков размером 0,7 x 50 см2 с диапазоном разделения 0,7-10 мегадальтон (MDa), уравновешенной в PBS. Добавьте липосомы и выполняйте, как в шаге 1.6. Фракции, содержащие липосомы, будут иметь сниженное пропускание света в диапазоне 250–400 нм.
- Храните липосомы при температуре 4 °C и не замораживайте.
4. Поток кальция для мониторинга активации В-клеток антигенными липосомами
- Усыпляйте мышей путем передозировки углекислым газом (CO2) или изофлураном в соответствии со стандартными операционными процедурами учреждения. Подтвердить эвтаназию мышей путем вывиха шейки матки.
- Стерилизуйте хирургические инструменты и туши мышей с использованием 70% этанола. Используйте изогнутые щипцы для радужки длиной 10 см и наконечником 0,8 мм, чтобы отделить кожу, покрывающую грудную полость, от грудной клетки. С помощью прямых ножниц для пресечения длиной 10 см сделайте дистальный разрез с двусторонним разрезом.
- Используйте изогнутые щипцы для радужной оболочки глаза и препарирующие ножницы для извлечения селезенки из брюшной полости. Удалите жировую ткань, окружающую селезенку, а затем поместите ее в полистирольную коническую трубку объемом 15 мл, заполненную средой RPMI1640 содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и пенициллин-стрептомицин.
- Переведите селезенку и среду через клеточный фильтр 40 мкм, установленный на конической пробирке объемом 50 мл. С помощью резинового конца поршня шприца объемом 3 мл аккуратно раздавите селезенку. Промойте сетчатый фильтр 40 μм с помощью фильтрующего материала. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока в клеточном фильтре размером 40 мкм не останется только жировая ткань. Промойте сито 3-5 мл среды, чтобы увеличить восстановление клеток.
- Гомогенировать ячейки центрифуги при 300 x g в течение 5 мин при RT. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 10 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов. Пипетку вверх и вниз, оставьте на 2–3 минуты при RT, а затем центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте истощенные эритроцитами спленоциты в 10 мл среды. Определите общее количество клеток с помощью гемоцитометра или другого устройства для подсчета клеток. Гранулируйте ячейки центрифугированием, как описано выше.
Примечание: Идеальная конечная концентрация, необходимая для загрузки спленоцитов Индо-1, составляет 10–20 x 106 клеток/мл, но можно использовать более низкую концентрацию клеток.
- Ресуспендировать спленоциты в концентрации 15 x 106 клеток/мл в буфере для загрузки кальциевого потока (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 среда, содержащая 1% FCS, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ хлорида магния (MgCl2), 1 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N, N,N', N'-тетрауксусную кислоту (EGTA) и 5% пенициллин-стрептомицина). Добавьте 1,5 мкМ Indo-1 из стокового раствора ДМСО 1 мМ и переверните трубку несколько раз для перемешивания. Беречь от света и инкубировать клетки при температуре 37 °C на водяной бане в течение 30 минут.
- После 30-минутной инкубации добавьте в 5 раз больше буфера для загрузки кальциевого флюса. Центрифугируйте при 300 x g в течение 7 мин при RT.
- Для стробирования на В-клетках окрашивают клетки 1:200 антимышиным CD5-PE и антимышиным 1:200 B220-PE/Cy7 в 0,5 мл загрузочного буфера при 4 °C в течение 20 мин, защищенном от света.
- Промыть спленоциты в буфере для загрузки кальциевого флюса и центрифугировать при 300 x g в течение 7 мин при RT. Ресуспендировать клетки при концентрации 10–20 x 106 клеток/мл в буфере для работы с кальциевым флюсом (сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), содержащий 1% FCS, 1 мМ MgCl2 и 1 мМ хлорида кальция (CaCl2)). Хранить на льду, защищенном от света до готовности к запуску на проточном цитометре.
- Настройте проточную цитометрию с контролем неокрашенного и одинарного окрашивания для компенсации.
- Запустите окрашенные клетки, чтобы правильно настроить ворота (см. рисунок 1A). Настройте график Indo-1 (фиолетовый) и Indo-1 (синий), отрегулируйте напряжения в каналах Indo-1 так, чтобы окрашивание клеток находилось под углом 45–60° для максимизации сигнала: отношение шума Indo-1 фиолетовый: изменение отношения синего после стимуляции B-клеток><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что напряжение не слишком высокое, чтобы значительный процент элементов (>5%) находился против верхней части графика.
- Создайте диагональный вентиль, который инкапсулирует верхнюю левую часть графика (фиолетовый + синий-) таким образом, чтобы без стимуляции <10% клеток находились в затворе, который в идеале должен увеличиться до >75% после стимуляции.
- Добавьте 0,5 мл клеток в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл (трубка для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS)) и нагревайте клетки до 37 °C в течение 3–5 минут на водяной бане. Поместите трубку FACS в камеру с водяной рубашкой при температуре 37 °C, которая подключена к водяной бане с рециркуляцией.
- Проведите пробирку в водяной рубашке на проточном цитометре и начните сбор данных, не сохраняя данные, со скоростью примерно 5000–10000 событий/с. После стабилизации клеток (15–30 с) инициируйте сбор данных и собирайте данные в течение не менее 10 с для установления фона.
- На отметке 10 соплей быстро извлечь трубку из проточного цитометра, добавить стимуляцию (5-50 мкМ антигенных липосом в 2–20 мкл), импульсный вихрь и вернуть трубку FACS на проточный цитометр. Обеспечьте сбор и хранение данных в течение этого времени и собирайте данные в течение 3–5 минут.
- Анализируйте данные в соответствующем программном обеспечении для анализа с помощью функций кинетики.
Таблица 1: Расчеты для создания липосомы с общей концентрацией липидов 1,25 мкМ.Пример таблицы расчета для липосом фрагмента IgM F(ab) козы против мыши.
г.
T
См.
мм
См.
См.
Кабель
Сталь
| Мвт | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| ДСПК | холестерин | PEG-DSPE | избыток PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | итог |
| Молярное соотношение | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100.00 |
| Масса (мг) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| ММОЛЬ | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0.00 | 1.25 |
| мл | 112,50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755,03 |
| | | (мг/мл) | | | |
| | ДСПК | 5 | | | |
| | холестерин | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | 2 | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0,114 | | | |
