Бактериальная культура фильтрует концентрацию белка с помощью ультрафильтрационного устройства

Аннотация

Источник: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Обогащение внеклеточных везикул с помощью эксклюзионной хроматографии. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Это видео демонстрирует выделение и концентрацию белков фильтрата бактериальной культуры, которые включают бактериальные внеклеточные везикулы, с помощью ультрафильтрации. Концентрированные внеклеточные везикулы служат диагностическими маркерами для выявления заболеваний.

Протокол

1. Получение концентрата внеклеточных везикул (EV) сырой Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробных процедур по выращиванию Mtb и приготовлению культурного фильтрата белка (CFP). Рекомендуется, чтобы бактериальные питательные среды не содержали добавок для роста с EV-содержащими или белковыми компонентами, такими как олеиновый альбумин, декстроза каталазы (OADC), и моющих средств, таких как Tween. Также рекомендуется проводить скрининг качества бактериальной культуры и собранного CFP для обеспечения ограниченной гибели и лизиса клеток.

1. Приготовьте центробежный фильтр с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) (см. Таблицу материалов), добавив полную объемную емкость фосфатно-солевого буфера (1x PBS). Центрифуга в течение 5 мин при 2 800 x g при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прииспользовании фильтра без мертвой остановки необходимо следить за тем, чтобы объем образца не опускался ниже уровня фильтра, что приводит к полному высыханию фильтра во время центрифугирования.
2. Выбросьте проточный и оставшийся PBS перед заполнением пробоотборной камеры Mtb CFP до максимальной производительности. Центрифугируйте при давлении 2 800 x g при 4 °C до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства. При необходимости повторите, добавляя больше CFP в устройство, пока вся проба не будет достаточно уменьшена.
   заметка: При необходимости сохраните часть проточного материала с током 100 кДа (100F) для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.
3. Добавьте 1x PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите объем, как описано в пункте 1.2. Повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и замену буфера.
4. Восстановите концентрированный ретентат CFP с концентрацией 100 кДа (100R) в соответствии со спецификациями устройства ультрафильтрации (см. Таблицу материалов). После восстановления 100R промойте фильтр минимальным объемом 1x PBS не менее трех раз и объедините промывку с 100R для максимального восстановления.
5. Количественное определение материала 100R с помощью бицинхонового анализа (BCA) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для проведения анализа используйте несколько разведений образцов 1:2, 1:5 и 1:10 в PBS. Протестируйте образец в triplicate.
   заметка: При необходимости сохраните часть материала 100R для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматический сборщик фракций	Наука IZON	АФК-В1-ДОЛЛАР США
Centricon Plus - 70 Центробежный фильтр, отсечка 100 кДа	Миллипора Сигма	UFC710008	Ультрафильтрационное устройство, используемое на шаге 1.1
Фосфатно-солевой буфер, 1X без кальция и магния	Корнинг	21-040-ЧВ
Нитроцеллюлозная мембрана, рулон, 0,2 мкм	БиоРад	1620112