1. Приготовление сырого концентрата Mtb EV
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры по выращиванию Mtb и приготовлению культурного фильтрата белка (CFP) см. в разделе Ссылки. Рекомендуется, чтобы бактериальные питательные среды не содержали добавок для роста с EV-содержащими или белковыми компонентами, такими как олеиновый альбумин, декстроза каталазы (OADC), и моющих средств, таких как Tween. Также рекомендуется проводить скрининг качества бактериальной культуры и собранного CFP для обеспечения ограниченной гибели и лизиса клеток.
- Приготовьте центробежный фильтр с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) (см. Таблицу материалов), добавив полную объемную емкость фосфатно-солевого буфера (1x PBS). Центрифуга в течение 5 мин при 2 800 x g при 4 °C.
заметка: При использовании фильтра без мертвой остановки необходимо следить за тем, чтобы объем пробы не опускался ниже уровня фильтра, что приводит к полному высыханию фильтра во время центрифугирования.
- Выбросьте проточный и оставшийся PBS перед заполнением пробоотборной камеры Mtb CFP до максимальной производительности. Центрифугируйте при давлении 2 800 x g при 4 °C до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства. При необходимости повторите, добавляя больше CFP в устройство, пока вся проба не будет достаточно уменьшена.
заметка: При необходимости сохраните часть проточного материала с током 100 кДа (100F) для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.
- Добавьте 1x PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите объем, как описано в пункте 1.2. Повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и замену буфера.
- Восстановите концентрированный ретентат CFP с концентрацией 100 кДа (100R) в соответствии со спецификациями устройства ультрафильтрации (см. Таблицу материалов). После восстановления 100R промойте фильтр минимальным объемом 1x PBS не менее трех раз и объедините промывку с 100R для максимального восстановления.
- Количественное определение материала 100R с помощью бицинхонового анализа (BCA) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для проведения анализа используйте несколько разведений образцов 1:2, 1:5 и 1:10 в PBS. Протестируйте образец в triplicate.
заметка: При необходимости сохраните часть материала 100R для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.
2. Эксклюзионная хроматография для обогащения электромобилей Mtb из CFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура специфична для использования 3 мг 100R Mtb CFP с колонной SEC и автоматическим сборщиком фракций (AFC, см. Таблицу материалов). Он может быть адаптирован для других начальных концентраций и типов колонн в соответствии со спецификациями производителя. Кроме того, пользователям рекомендуется прочитать и понять руководство пользователя автоматического сборщика фракций.
- Дайте колонне SEC уравновеситься до комнатной температуры.
- Включите AFC с помощью выключателя питания на задней панели башенного блока и при необходимости отрегулируйте настройки тензодатчика, нажав кнопку SETUP на сенсорном экране главного меню. Тензодатчик должен быть откалиброван только при первом использовании, после каждого обновления программного обеспечения, а также в случае обнаружения несоответствия объемов сбора фракций.
- На экране НАСТРОЙКА выровняйте карусель, выбрав КАРУСЕЛЬ, > КАЛИБРОВКА. Вставьте карусель 13 маленькими отверстиями вверх в башню AFC и отрегулируйте карусель так, чтобы сопло жидкости находилось прямо над положением заподлицо, нажав кнопки - и/или +.
- Снимите колпачки со столбца уравновешенной SEC. Вставьте колонну SEC в соответствующее крепление для колонны и аккуратно установите ее на башню AFC. Убедитесь, что метка радиочастотной идентификации (RFID) на колонне обращена к AFC, и убедитесь, что соединение между колонной и клапаном надежно. Поместите трубку для выпуска отходов в контейнер для сбора.
- На экране НАСТРОЙКА выберите График сбора и установите количество на 13 и размер на 0,5 мл, нажав кнопки - и/или +. Оставьте настройку "Buffer Volume" по умолчанию равной 2,7 мл, а затем закройте окно "Collection Schedule", нажав X.
- Выберите «НАЧАТЬ СБОРКУ» на главном экране и подтвердите параметры коллекции, выбрав «ДА». Загрузите 13 пробирок для микроцентрифуг объемом 1,7 мл с открытыми крышками, направленными к центру карусели.
- Переместите AFC, выбрав OK, затем установите резервуар колонны и снова переместите его, нажав OK. Выберите вариант очистки столбца, нажав клавишу YES, и добавьте один объем столбца 0,2 мкм отфильтрованного PBS, чтобы удалить любой буфер хранения. Как только промывка будет завершена, переместите AFC, нажав OK.
- Наденьте крышку карусели на AFC и нажмите OK. Приготовьте в одной колонке объемом 0,2 мкм отфильтрованный PBS. С помощью пипетки удалите излишки буфера из колонки.
- Доведите до 3 мг образца 100R, определенного на шаге 1,5, до 500 мкл с 1x PBS. Добавьте образец 3 мг в верхнюю часть столбца. Продвинуте AFC и дайте образцу влиться во фритту. После того, как проба полностью поступила в колонку, добавьте в резервуар ПБС, приготовленный на шаге 2.6.
- Контролируйте прогон AFC, пока он собирает сначала объем пустоты, а затем указанные дроби. После того как прогон завершится и карусель вернется в мусорное положение, снимите крышку и извлеките из карусели пробирки для фракций. Храните фракции при температуре 4 °C перед количественным определением (этап 3) и квалификацией (этап 4).
- Если колонка должна использоваться повторно, выберите опцию очистки колонки, нажав клавишу YES, в противном случае нажмите кнопку NO. Следуйте инструкциям на AFC.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как колонна промыта и буфер для хранения исчерпан, его можно снять, закрыть крышкой и хранить при температуре 4 °C.
