Метод zWEDGI для визуализации личинок рыбок данио, инфицированных грибковыми патогенами

Аннотация

Источник: Thrikawala, S. et al., Заражение личинок данио-рерио спорами Aspergillus для анализа взаимодействия хозяина и патогена.J. Vis. Exp.(2020)

Видео демонстрирует технику устройства для нанесения ран и захвата рыбок данио-рерио для наблюдения за флуоресцентно меченой грибковой патогенной инфекцией у личинок данио-рерио. Первоначальная инфекция привлекает макрофаги, и по мере сохранения инфекции рекрутирование нейтрофилов прогрессирует в месте инъекции.

Протокол

1. Подготовка спор Aspergillus к инъекциям

1. Из суспензии спор Aspergillus рассчитайте объем, необходимый для получения 1 x 10⁶ спор. Объем должен составлять 20–100 μл; если нет, производят 10-кратное разведение в 0,01% (v/v) стерильном Tween-20 (Tween-water; Таблица материалов). Например, если рассчитанный объем составляет 5 мкл, произведите 10-кратное разбавление и используйте 50 мкл разбавленного раствора><. заметка: Две пластины/штамма могут быть подготовлены для сбора большего количества спор или в качестве запасных в случае загрязнения.
2. Распределите 1 x 10⁶ спор Aspergillus на одной пластине с минимальной глюкозой (GMM) (Table of Materials) с помощью стерильного одноразового L-образного разбрасывателя в шкафу для биобезопасности. Избегайте растекания по краям тарелки. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 3–4 дней, положив пластину вверх дном.
3. В день сбора принесите в бокс биобезопасности стерильную салфетку и конические пробирки объемом 50 мл (по две на сорт), свежие флаконы со стерильной водой Tween-water (по одной на сорт) и стерильные одноразовые L-образные разбрасыватели.
   заметка: Miracloth можно разрезать на ~8 x 6 кусочков, завернуть в фольгу и автоклавировать для стерилизации.
4. Поместите по одному куску ткани miracloth в каждую промаркированную коническую пробирку объемом 50 мл и снова закройте крышкой. Достаньте оставшийся пакет с тканью из капюшона.
5. Занесите тарелки в шкаф биобезопасности. Откройте одну тарелку, затем налейте сверху Tween-воду, чтобы покрыть примерно три четверти тарелки.
6. С помощью одноразового Г-образного разбрасывателя аккуратно соскребите поверхность грибковой культуры вперед и назад, в то время как другой рукой вращайте пластину. Соскребите до тех пор, пока почти все споры не будут гомогенизированы в воде Tween.
   заметка: Из-за высокой гидрофобности споры могут создавать «затяжки» при добавлении воды для подростков или во время соскабливания. Следует соблюдать большую осторожность, чтобы избежать загрязнения близлежащих трубок или планшетов. Рекомендуется менять перчатки и протирать поверхность 70% этанолом между экстракцией разных штаммов.
7. Возьмите одну коническую трубку объемом 50 мл и удалите кусок ткани. Сложите его пополам и превратите в фильтр, вставленный в верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл.
8. Вылейте в пробирку гомогенат грибов с тарелки поверх ткани мира.
   заметка: Если подготовлены две пластины одного штамма, соскребите обе пластины и вылейте их в одну коническую трубку.
9. Налейте воду в твин, чтобы довести общий объем в конической трубке до 50 мл.
10. Отжимайте при давлении 900 x g в течение 10 мин. Обязательно используйте в центрифуге крышки, предотвращающие распыление.
11. Слейте надосадочную жидкость в ~10% раствор отбеливателя для обеззараживания. Налейте 50 мл стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) в коническую трубку, затем сделайте вихрь или встряхните, чтобы повторно суспендировать гранулу.
12. Снова вращайте при 900 x g в течение 10 мин. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл стерильного 1x PBS. Процедите через свежий кусок ткани в свежую коническую пробирку объемом 50 мл.
13. Сделайте 10-кратное серийное разведение (10x, 100x, 1000x) гомогената гриба в центрифужных пробирках объемом 1,7 мл (например, для раствора 10x смешайте 100 μл гомогената гриба с 900 μл Tween-воды).
14. Выберите первое разведение, при котором споры не видны при его сбросе в Tween-воду и используйте это разведение для подсчета количества спор с помощью гемоцитометра.
15. Рассчитайте концентрацию спор в приготовленном гомогенате гриба (водной суспензии) по следующей формуле:
    Концентрация (спор/мл) = Количество спор в середине 25 коробок x фактор разбавления x 10⁴
16. Приготовьте 1 мл бульона 1,5 x 10⁸ спор/мл в стерильном 1x PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл. Этот споровый препарат можно хранить при температуре 4 °C в течение ~4 недель.
17. Перед использованием в инъекциях смешайте 20 мкл спорового препарата с 10 мкл 1% стерильного фенолового красного в центрифужной пробирке объемом 1,7 мл для достижения конечной концентрации спор 1 x 10⁸ спор/мл. Перед инъекцией тщательно обработать вихрь. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: 1% раствор фенольного красного следует стерилизовать фильтром и хранить в аликвотах.
18. Для имитации инъекции смешайте 20 мкл 1x PBS с 10 мкл 1% стерильного фенолового красного.

2. Подготовка агаровых пластин к инъекциям

1. Приготовьте 2% агарозу в среде Е3 и растопите в микроволновке.
2. Налейте в чашку Петри размером 100 мм x 15 мм (~25 мл на тарелку), перемешайте, чтобы равномерно накрыть тарелку, и дайте остыть.
3. Оберните тарелку парафиновой пленкой и храните в перевернутом виде при температуре 4 °C.
4. Перед инъекцией доведите планшет до комнатной температуры (RT).
5. Налейте ~1 мл стерилизованного фильтром 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на тарелку, наклоните пластину, чтобы распределить и покрыть все дно, и промойте E3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2% раствор BSA можно стерилизовать фильтром и хранить в виде 1 мл аликвот при -20 °C. Предварительная обработка 2% BSA предотвращает прилипание личинок к поверхности агарозы.
6. Налейте Е3 с буферным трикаином на пластину и оставьте до инъекции.

3. Микроинъекция заднего желудочка личинок данио-рерио

1. Вручную дехорионировать личинок щипцами при 2 dpf в чашке Петри.
   заметка: Дехорионация может быть выполнена в любое время от 1,5 dpf до момента инъекции.
2. Удалите как можно больше Е3 из чашки Петри и добавьте буферизованный трикаин 300 мкг/мл в Е3 для обезболивания личинок. <бр/> заметка: Стоковый раствор буферизованного трикаина в концентрации 4 мг/мл в Е3 может быть приготовлен и храниться при температуре 4 °С. Рабочий раствор может быть получен путем разведения 4 мл стокового раствора до 50 мл с Е3.
3. Используйте установку для микровпрыска, входящую в комплект поставки инжектора давления, блока обратного давления, ножного переключателя, держателя микропипетки, микроманипулятора, а также магнитной подставки и пластины, подключенных к источнику сжатого воздуха (Таблица материалов).
4. Откройте клапан сжатого воздуха и включите микроинжектор. Установите давление на ~25 фунтов на квадратный дюйм, продолжительность импульса на 60 мс, а единицу измерения обратного давления на 1 фунт на квадратный дюйм (PSI).
5. Загрузите иглу для микроинъекций с помощью наконечника для пипетки микрозагрузчика (Таблица материалов) примерно 3–5 мкл приготовленной PBS или споровой суспензии с феноловым красным. Установите иглу на микроманипулятор.
   заметка: Иглы для микроинъекций могут быть приготовлены, как описано ранее. Стереомикроскоп, используемый для микроинъекций, должен иметь прицельную сетку окуляра для калибровки иглы для микроинъекций. Прицельная сетка должна быть откалибрована с помощью ступенчатого микрометра, и должна быть определена длина шкалы прицельной сетки (мкм). Диаметр капли споровой суспензии, которая выбрасывается из иглы, измеряется в зависимости от количества хешей (прицельной сетки), которые перекрываются с каплей.
6. Расположите микроманипулятор так, чтобы конец иглы был виден при наименьшем увеличении под стереомикроскопом. Увеличьте масштаб до 4-кратного увеличения, держа иглу в поле зрения.
7. С помощью острых щипцов зафиксируйте конец иглы. Нажмите на педаль впрыска, чтобы визуализировать размер выходящей капли. Продолжайте обрезать до тех пор, пока не будет введено ~3 нл споровой суспензии (здесь это пять хешей).
8. Отодвиньте микроманипулятор и иглу в сторону, чтобы избежать случайного попадания в иглу, пока личинки располагаются на инъекционной пластине.
9. Вылейте E3-Tricaine с инъекционной пластины, затем перенесите ~24 обезболенные личинки на инъекционную пластину с как можно меньшим количеством E3 с помощью передаточной пипетки.
10. Используя небольшой инструмент для манипуляций с личинками данио-рерио (т.е. инструмент для петли для волос или инструмент для ресниц), расположите личинок в соответствии с направлением, в котором они смотрят. В частности, поместите всех лиц, обращенных вправо, в одном ряду, и всех, кто обращен влево, в ряд ниже.
    заметка: Такое расположение затруднительно, если на пластине слишком много жидкости, так как личинки будут «плавать» не на своем месте. Однако слишком мало жидкости также проблематично, если инъекции занимают много времени, так как личинки могут высохнуть или анестезия может стереться. Таким образом, следует уделять пристальное внимание количеству жидкости на пластине на протяжении всего процесса микроинъекции.
11. Отрегулируйте зум микроскопа до минимального увеличения. Верните микроманипулятор обратно и расположите его так, чтобы игла находилась близко к личинкам, под углом ~30°–60°, в центре поля зрения.
12. Увеличьте масштаб до максимального увеличения и используйте ручки точной регулировки для дальнейшей регулировки положения иглы. Убедитесь, что ~30–70 спор выходят из иглы, введя споровую суспензию в жидкость на пластине рядом с личинками. При необходимости отрегулируйте время и давление на настройку впрыска.
    заметка: Этот тест следует повторять каждые пять-шесть личинок, так как количество спор, выходящих из иглы, со временем может увеличиваться или уменьшаться.
13. Начиная с ряда, в котором личинки обращены к игле, переместите пластину так, чтобы игла оказалась прямо над и располагалась рядом с первыми личинками.
14. Перемещая иглу с помощью микроманипулятора, введите иглу через ткань вокруг глазного пузырька, чтобы проколоть ее в задний желудочек мозга. Перемещайте пластину другой рукой по мере необходимости, чтобы получить правильную ориентацию личинки с углом иглы.
15. Визуально убедитесь, что конец иглы находится в центре заднего желудочка мозга, нажмите на ножную педаль, чтобы ввести споры, и осторожно втяните иглу.
    заметка: Феноловый красный краситель должен в первую очередь оставаться в желудочке заднего мозга. Небольшое количество может попасть в средний мозг, но оно не должно достигать переднего мозга или за пределы мозга. Если это так, то объем ввода слишком велик, и давление и время должны быть соответственно уменьшены, или следует откалибровать новую иглу.
16. Двигаясь вниз по пластине, введите всех личинок в тот ряд. Затем переверните пластину и введите всех личинок в другой ряд.
    заметка: Неудачно введенные или случайно поврежденные личинки можно пометить 1) введением в желток пару раз для создания красной метки или 2) вытаскиванием личинки из ряда с иглой.
17. Снова переместите иглу вверх и в сторону. Уменьшите масштаб до меньшего увеличения на микроскопе. Феноловый красный краситель все еще должен быть виден в заднем мозге каждой личинки.
18. Сначала оттяните инструмент с петлей для волос и пипеткой вверх, чтобы избавиться от личинок с неудачными инъекциями. Переложите оставшихся личинок в новую чашку Петри, смыв их с тарелки свежим стерильным Е3 и передаточной пипеткой.
19. Повторите по мере необходимости для получения желаемого окончательного номера экспериментального образца.
20. Промойте личинки не менее 2 раз Е3 и обеспечьте восстановление после анестезии.
21. Чтобы количественно оценить выживаемость без какой-либо дополнительной обработки, с помощью передаточной пипетки перенесите личинок в 96-луночный планшет (1 личинка на лунку) в E3.

4. Определение количества инжектированных и жизнеспособных спор

1. Сразу после инъекции с помощью передаточной пипетки случайным образом отоберите около восьми введенных личинок и перенесите их в центрифужные пробирки объемом 1,7 мл (по одной личинке на пробирку).
2. Усыпляют личинок трикаином или помещают их при температуре 4 °C на 0,5–2,0 ч.
3. Приготовьте 1 мл растворов антибиотиков ампициллина 1 мг/мл и 0,5 мг/мл канамицина в стерильном 1x PBS. Оставшийся раствор можно хранить при температуре 4 °C и использовать позже.
   заметка: Исходные растворы ампициллина в концентрации 100 мг/мл и канамицина в концентрации 50 мг/мл могут быть предварительно изготовлены, стерилизованы фильтром и сохранены в аликвотах при температуре -20 °C. Разбавьте их в 100 раз в 1x PBS для получения рабочего раствора.
4. С помощью пипетки удалите как можно больше жидкости из центрифужной пробирки, оставив личинку, и добавьте 90 мкл 1x PBS с антибиотиками.
   заметка: Антибиотики используются для предотвращения роста бактерий в пластинах GMM, которые могут мешать подсчету колоний Aspergillus.
5. Гомогенизировать личинок в тканевом лизоре со скоростью 1800 колебаний/мин (30 Гц) в течение 6 мин. Отжимать при 17000 x g в течение 30 с.
6. Этикетка пластин GMM (одна пластина на гомогенизированную личинку). Используя горелку Бунзена для создания стерильной среды, пипетируйте гомогенизированную суспензию из одной пробирки до середины пластины ГММ, затем распределите с помощью одноразового L-образного разбрасывателя. Избегайте растекания гомогената по краю.
7. Инкубируйте планшеты вверх дном при температуре 37 °C в течение 2–3 дней и подсчитайте количество образовавшихся колоний, колониеобразующую единицу (КОЕ).
8. Чтобы измерить количество живых спор в период заражения, выберите личинки из 96-луночных планшетов через 1–7 дней после впрыска (dpi) и перенесите их в центрифужные пробирки. Усыпьте и гомогенизируйте личинки для распространения на планшетах GMM, как описано в шагах 4.1–4.5.

5. Медикаментозное лечение инъекционных личинок

1. После секции 4 разделите оставшиеся введенные личинки на две чашки диаметром 3,5 мм: одну для лечения препаратом, а другую для контроля. Используйте около 24 инфицированных личинок на одно состояние.
   заметка: Посуду диаметром 3,5 мм можно обрабатывать 2% обезжиренным сухим молоком в воде, промывать, сушить на воздухе и предварительно хранить при RT. Покрытие молочком предотвратит прилипание личинок к пластику.
2. Приготовьте нужный раствор препарата и носитель в Е3 без метиленового синего в конических пробирках в соответствии с требуемой конечной концентрацией, затем хорошо перемешайте. Например, для мониторинга выживаемости личинок, подвергшихся воздействию дексаметазона, используют 24 личинки (реплики) для дексаметазона и 24 для контроля транспортных средств, такие как диметилсульфоксид (ДМСО). Приготовьте 5 мл раствора препарата в необходимой концентрации. Здесь использовали 5 мл 0,1% ДМСО и 10 мкМ дексаметазона, а 24 личинки/состояние переносили в ~200 мкл носителя/лекарственного раствора/личинок.
3. Удалите как можно больше жидкости из одной чашки с помощью переводной пипетки и добавьте предварительно смешанный E3, содержащий управление транспортным средством. Повторите то же самое с готовой смесью E3, содержащей интересующую обработку для другого блюда.
4. С помощью пипетки перенесите личинок в 96-луночный планшет (по одной личинке на лунку). Контролируйте выживаемость введенных личинок, подвергшихся воздействию носителя или препарата><, в течение 7 дней. заметка: Препарат можно наносить исключительно в день заражения и держать на личинках в течение всего эксперимента или же ежедневно освежать.

6. Ежедневная визуализация инфицированных личинок с помощью устройства для роста и визуализации ран и ловли рыбок данио (zWEDGI)

1. Убедитесь, что личинки обрабатываются 100 мкМ N-фенилтиомочевиной (PTU) в дозе 24 hpf для предотвращения пигментации и что PTU сохраняется на личинках в течение всего эксперимент><а. заметка: ПТУ при концентрации 75–100 мкМ предотвращает пигментацию личинок без каких-либо грубых пороков развития. Тем не менее, ПТУ может вмешиваться в некоторые биологические процессы, и исследователи должны заранее определить, может ли препарат влиять на какие-либо исследуемые процессы.
2. Инфицируйте трансгенных личинок с мечеными клеточными популяциями, представляющими интерес на уровне 2 dpf, спорами Aspergillus, сконструированными для экспрессии флуоресцентного белка, как описано в разделе 3. Затем перенесите инфицированных личинок в лунки 48-луночного планшета в концентрации около 500 мкл/лунка Е3 без метиленового синего.<бр/> заметка: Здесь используется 48-луночный планшет, потому что его легче переносить внутрь и из него во время повторяющейся ежедневной визуализации.
3. В день визуализации приготовьте две чашки Петри 3,5 мм: одну со 100 мкМ PTU и одну с E3-трикаином.
4. Добавьте E3-трикаин в камеры устройства zWEDGI. Под стереомикроскопом удалите пузырьки воздуха из камер и удерживающего канала с помощью микропипетки Р100. Удалите все излишки Е3-трикаина, чтобы он был только в камерах.
5. Пипеткой отведите одну личинку от пластины с помощью переводной пипетки. Если для его удаления используется много жидкости, поместите его пипеткой в чашку диаметром 3,5 мм, содержащую E3-PTU. Затем снова пипеткуйте, используя как можно меньше жидкости, и переведите в Е3-трикаин.
6. Подождите ~30 с для обезболивания, затем перенесите в загрузочную камеру устройства для ранения и захвата (например, zWEDGI).
7. Под стереомикроскопом расположите личинку. С помощью микропипетки Р100 удалите Е3-трикаин из камеры ранения и выпустите его в загрузочную камеру, чтобы переместить хвост личинки в рестрикционный канал. Убедитесь, что личинка расположена на боковой, дорсальной или дорсолатеральной стороне, чтобы задний мозг можно было визуализировать с помощью перевернутой линзы объектива.
8. Изображение личинки с помощью конфокального микроскопа.
9. После визуализации с помощью пипетки P100 выпустите E3-трикаин в ранящую камеру, чтобы вытолкнуть личинку из ограничивающего канала в загрузочную камеру.
10. С помощью переводной пипетки подхватите личинку и перенесите ее обратно в чашку Петри с Е3-трикаином. Используя как можно меньше жидкости, переложите ее в чашку Петри с Е3-ПТУ. Промойте в PTU и переложите обратно в 48-луночный планшет.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Щипцы Dumont #5	Робоз Хирургический Инструмент Ко.	РС-5045
Прицельная сетка окуляра	Мир микроскопов	RETR10	Для калибровки игл, используется в стереомикроскопе
Настройка микроинъектора: блок обратного давления	Прикладное научное приборостроение	БПА
Ножной переключатель	Прикладное научное приборостроение	ФТЗ
Комплект держателей для микропипеток	Прикладное научное приборостроение	М-пип
Напорный инжектор	Прикладное научное приборостроение	МППИ-3
Настройка микроманипулятора: Микроманипулятор	Нарасигэ (Tritech)	М-152
Магнитная подставка и пластина	Тритех	МИНЬ-ХБМБ
Съемник игл	Инструмент Саттера	-97
Стереомикроскоп	Компания Nikon	СМЗ-745
Тканевый лизер II	Цягэн	85300	Для гомогенизации личинок
материал
агароза	рыбак	БП160-500
Ампициллина натриевая соль	рыбак	AAJ6380706
BSA, фракция V	ВВР	AAJ65855-22
Канамицина сульфат	рыбак	AAJ1792406
Разбрасыватели L	рыбак	14 665 230
Микрокапиллярные иглы (без нити)	Мировые прецизионные приборы (WPI)	ТВ100-3
Наконечники для микрозагрузчиков	ВВР	89009-310	Нагружать иглу суспензией Aspergillus
Мираткань	ВВР	EM475855-1Р	Фильтровать суспензию Aspergillus
N-фенилтиомочевина	рыбак	AAL0669009	Для профилактики пигментации
Фенол красный, 1% раствор	рыбак	57254
Трикаин (этил3-аминобензоат, соль метансульфоновой кислоты)	рыбак	AC118000500	Для обезболивания личинок
Подросток-20	рыбак	БП337-500
Медиа и решения			Компоненты/Рецепт
Медиа E3: 60x E3			17,2 г NaCl, 0,76 г KCl, 2,9 г CaCl2, 4,9 г MgSO4 · 7H2O, до 1 л H2O
1x E3			16,7 мл 60x стоек, 430 мкл 0,05 М NaOH, до 1 л с H2O (опционально: + 3 мл 0,01% метиленового синего)
Исходный раствор трикаина			2 г трикаина, 5 г Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 мл 60X E3, до 500 мл с H2O, pH до 7,0-7,5 с NaOH
Агар с минимальной глюкозой (ГММ): ГММ агар			10 г глюкозы (декстрозы), 50 мл 20x солей нитратов, 1 мл TE, до 1 л с H2O, pH до 6,5 с NaOH, + 16 г агара, автоклав
20x Нитратные соли			120 г NaNO3, 10,4 г KCl, 10,4 г, MgSO4 · 7H2O, 30,4 г, KH2PO4, до 1 л с H2O, автоклав
Микроэлементы (TE)			2,20 г ZnSO4 · 7H2O, 1,10 г H3BO3, 0,50 г MnCl2 · 4H2O, 0,16 г FeSO4 · 7H2O, 0,16 г CoCl2 · 6H2O, 0,16 г CuSO4 · 5H2O, 0,11 г (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 г Na2EDTA, до 100 мл с H2O, растворить при помешивании на ночь, автоклав

Кабель