Метод фотоконверсии для изучения динамики воспалительных клеток в куколках насекомых

Abstract

Источник: Weavers, H. et al., Долгосрочное отслеживание in vivo динамики воспалительных клеток в куколках дрозофилы.J. Vis. Exp. (2018)

Видео демонстрирует использование фотоконверсии для изучения динамики воспалительных клеток в куколках дрозофилы. Зеленые гемоциты тянутся к раненому эпителию, после чего следует дальняя миграция. Фотоконверсия сдвигает определенные гемоциты из зеленого в красный, облегчая отслеживание их движения.

Protocol

Этот протокол состоит из четырех основных последовательных этапов: (1) Подготовка стадий дрозофилы и стадирование куколок дрозофилы, (2) препарирование и монтирование куколок, (3) ранение куколки, (4) покадровая конфокальная визуализация in vivo.

1. Подготовка запасов дрозофил и стадирование куколок

1. Получите соответствующие запасы дрозофил (см. Введение и Таблицу материалов).
2. Соберите молодь здоровых взрослых мух соответствующего генотипа.
   1. Выберите взрослых мух, используя газовые прокладки с углекислым газом для кратковременного обезболивания мух и тонкую кисть для переноса мух соответствующего генотипа или пола во флакон для сбора.
   2. Добавьте 20 девственных самок и 20 самцов в каждый флакон, содержащий стандартные пищевые среды для мух (смесь кукурузной муки, патоки и агара, см. Таблицу материалов), дополненные дрожжами.
3. Для оптимального размножения куколок каждый день перекладывайте взрослую муху на новый корм в свежих флаконах, поддерживая во всех флаконах температуру 25 °C.
   заметка: Если для управления экспрессией генов, специфичных для линии, используется система активирующей последовательности Gal4-восходящего потока (Gal4-UAS), все этапы следует выполнять при температуре 25 °C или выше, так как система Gal4-UAS чувствительна к температуре.
4. За 18 ч до запланированного сеанса визуализации выберите не менее 10 вновь образованных белых предкуколок (рис. 1A) из флаконов (т.е. через 0 ч после образования пупария, APF) с помощью щипцов или тонкой кисти, чтобы выбить куколки с внутренней поверхности флакона и осторожно перенести куколки на сторону чистого пустого пластикового флакона><. заметка: Блуждающие личинки^3-го возраста выползают вверх из пищевой среды для окукливания; Новообразованные белые предкуколки легко идентифицировать, так как они обладают вывернутыми передними дыхальцами и неподвижны (в отличие от личинок^3-го возраста). Кутикула превращается в «пупарий» (куколку), которая изначально мягкая и белая. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить куколки, так как это может привести не только к нежелательной воспалительной реакции, вызванной травмой, но и к значительной задержке развития.
5. Состарить выбранных куколок до соответствующей стадии развития (18 ч APF даст оптимальные результаты) во флаконе при температуре 25 °C.
   заметка: По мере развития куколок оболочка куколки будет становиться все более темной и хрупкой.
6. Заранее подготовьте другие реагенты для следующего шага. Чтобы приготовить гептановый клей, соедините свернутый двусторонний скотч длиной 20 см с 20 мл гептана в центрифужной пробирке объемом 50 мл, запечатайте парафиновой пленкой и проложите при комнатной температуре ночь на скамейке.

2. Подготовка и вскрытие куколок дрозофилы

1. Перенесите постановочные куколки дрозофилы на кусок двустороннего липкого скотча, закрепленный на предметном стекле. Расположите куколок так, чтобы брюшная сторона была плотно приклеена к ленте, а тыльная сторона была обращена вверх (рис. 1B).
   заметка: Передняя часть куколки будет опознана по двум дыхальцам, выступающим из переднего конца куколки.
2. Осторожно извлеките куколок из защитной оболочки пупария под светлопольным микроскопом с помощью щипцов и микроножниц (рисунок 1B-D).
   1. Первоначально сделайте разрез в самой передней области пупария с помощью щипцов (рисунок 1B). Убедитесь, что куколка в этой области полая и лишена ткани куколки, потому что куколки будут уменьшаться внутри корпуса во время раннего развития куколки.
   2. После этого первоначального разреза осторожно разорвите или разрежьте куколку в переднем и заднем направлениях с помощью щипцов или микроножниц (рисунок 1C) до тех пор, пока куколка полностью не освободится от коричневой непрозрачной ломкой оболочки (рисунок 1D).
      заметка: Куколки на этой стадии очень хрупкие и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать прокола поверхности куколки; Прокол очевиден, так как гемолимфа быстро вытекает из места прокола. Куколки с проколами, какими бы маленькими они ни были, следует выбросить.
3. Посадите куколок в посуду со стеклянным дном с помощью гептанового клея.
   1. С помощью наконечника пипетки объемом 20 мл нанесите каплю объемом 10 мл предварительно приготовленного гептанового клея (см. раздел 1.6 выше) на чашку со стеклянным дном.
   2. Дайте клею высохнуть в течение 5 секунд, прежде чем осторожно перенести рассеченные куколки на гептановый клей с помощью щипцов (рисунок 1E).
   3. Для облегчения ранения и визуализации выстройте куколок в ряд; рекомендуется примерно 5 куколок, но с опытом можно будет справиться и с большим количеством кукол.
      заметка: Использование гептанового клея рекомендуется при использовании вертикальных систем визуализации, но не является необходимым при использовании инвертированной системы. Если клей создает оптические аберрации во время визуализации, куколки можно разместить непосредственно на покровном стекле – естественной адгезии между тканью куколки и стеклом будет достаточно в большинстве случаев для стабильной визуализации, при условии соблюдения осторожности при перемещении чашки для визуализации между микроскопами.
4. Для достижения наилучших результатов установите куколки так, чтобы крыло было ровно на покровном стекле, при этом большая часть поверхности крыла находилась в непосредственном контакте с покровным стеклом (рис. 1F). Перекатывайте куколки с помощью щипцов, чтобы изменить их положение, чтобы убедиться, что крыло установлено правильно.
5. Чтобы предотвратить обезвоживание образца во время визуализации, добавьте кусок абсорбирующей фильтровальной бумаги, смоченный в дистиллированной воде, сбоку от чашки со стеклянным дном в конце монтажа, стараясь не потревожить куколок (рисунок 1E). Накройте блюдо крышкой. <бр/> заметка: Куколки теперь готовы к нанесению ранений и визуализации.

3. Лазерно-индуцированное ранение крыльев куколки дрозофилы

1. Перенесите чашку со стеклянным дном, содержащую установленных куколок, в широкопольный микроскоп, оснащенный перестраиваемой системой лазерной абляции.
   1. Используйте импульсный УФ-лазер для абляции с воздушным охлаждением и азотной накачкой, настроенный на 435 нм – подробнее см. Таблицу материалов; точная длина волны света, используемого для освещения, выбирается пользователем с помощью соответствующей ячейки красителя.
2. Используя светлопольную оптику, отрегулируйте элементы управления предметным столиком микроскопа, чтобы определить местоположение крыла куколки первой раненой куколки (рис. 1F).
3. Для достижения оптимальных результатов используйте объектив с масляной иммерсией 40X или 63X как для визуализации, так и для лазерной абляции; убедитесь, что используемая иммерсионная жидкость (масло или глицерин) одинакова между системами абляции и визуализации. Отрегулируйте микроскоп так, чтобы он фокусировался на плоскости эпителия крыла куколки, ближайшей к стеклянному покровному стекло (т.е. фокусируйтесь на области эпителия, которую нужно ранить) с помощью ручки точного управления фокусировкой.
4. С помощью регулировки предметного столика с помощью микроскопа расположите крыло куколки таким образом, чтобы область, подлежащая ранению, была непосредственно выровнена с известной целевой областью абляционного лазера.
5. Используйте предметное стекло аттенюатора плотности энергии, установленное на микроскопе, чтобы вручную отрегулировать уровень мощности абляционного света.
   заметка: Ползунок аттенюатора имеет щелчки и линейки для определения относительного уровня затухания и позволяет использовать воспроизводимые настройки.
6. Используя внешнее ручное управление триггером, активируйте абляционный лазер одним коротким щелчком спускового крючка, чтобы сделать рану. Проверьте внешний вид переходного пузырька воздуха в месте абляции, так как ранение обычно сопровождается им. Проверьте, было ли лазерное ранение успешным, используя соответствующие флуоресцентные фильтры для визуализации эпителия куколки.
   заметка: Будьте осторожны, чтобы избежать случайного воздействия лазерных лучей, так как отражение луча может привести к серьезному повреждению глаз или кожи.
7. Если ранение не удалось, измените фокальную плоскость (переместив фокус микроскопа немного выше или ниже текущего уровня фокусировки) и повторите однократное нажатие триггера абляции. В качестве альтернативы постепенно увеличивайте мощность лазера с помощью ползуна аттенюатора до тех пор, пока не будет достигнут желаемый размер раны.
8. Чтобы изменить частоту следования импульсов абляционного лазера, используйте ручку Repetition rate на задней панели управления (которая изменяет частоту от менее чем 1 импульс/с до 60 Гц). Для оптимального ранения установите частоту следования импульсов на 40 Гц.
9. Чтобы создать раны разного размера, используйте ползунок аттенюатора плотности энергии, чтобы вручную отрегулировать уровень мощности абляционного света.
10. Воздержитесь от ранения всех верхних куколок и используйте эти неудаленные куколки в качестве нераненых контрольных элементов.
11. Для получения стабильных результатов регулярно корректируйте систему абляции (используя соответствующее руководство по эксплуатации). Кроме того, очистите и заправьте ячейку резонатора красителя, которая контролирует длину волны лазера.

4. Интервальная конфокальная визуализация in vivo

1. Быстро перенесите чашку со стеклянным дном в соответствующий микроскоп для покадровой съемки.
   заметка: Для получения оптимальных результатов используйте высокоспециализированный конфокальный или вращающийся дисковый микроскоп, оснащенный чувствительными детекторами, которые могут обнаруживать как зеленый флуоресцентный белок (GFP), так и флуорофоры mCherry.
2. Чтобы получить изображение всего крыла куколки, используйте объектив с малым увеличением (например, 20X) (рис. 2A). Для визуализации заживления раны и сопутствующей воспалительной реакции с высоким пространственным разрешением используйте объективы с масляным погружением 40X (NA 1.3) или 63X (NA 1.4) объектива (см. репрезентативные изображения на рисунке 2B-D).
3. Откройте соответствующее программное обеспечение для захвата изображений, связанное с микроскопом.
4. Используя программное обеспечение для захвата изображений, включите соответствующие лазеры, например, лазеры 488 нм и 561 нм для визуализации флуорофоров GFP и mCherry, соответственно (щелкнув в соответствующих полях) и отрегулируйте мощность лазера и настройки усиления/смещения, чтобы дать достаточный флуоресцентный сигнал, избегая при этом насыщения пикселей; используйте минимально возможную мощность лазера (в диапазоне 5 - 20%) для минимизации фотообесцвечивания и фототоксичности.
5. Чтобы зафиксировать как восстанавливающийся эпителий, так и набор воспалительных клеток, настройте микроскоп на запись z-стека с помощью ручек точной регулировки фокусировки на панели управления; для достижения оптимальных результатов настройте программное обеспечение (с помощью ручных нажатий кнопок) на запись z-срезов через крыло куколки (минимум каждые 3 мм), от верхней части поврежденного эпителия до внеклеточного пространства под ним (содержащего мигрирующие гемоциты) для достижения большого z-стека (в диапазоне 50 - 100) мм).
6. Для покадровой съемки запишите z-стеки через равные промежутки времени (минимум каждые 30 с) в течение как минимум 1 часа после ранения.
   заметка: Точный временной интервал между выбранными z-стеками представляет собой компромисс между захватом быстро меняющейся динамики клеток и предотвращением фотообесцвечивания образцов.
7. Для одновременной визуализации нескольких куколок (включая неабляционные нераненые контрольные группы) используйте моторизованный предметный столик (прикрепленный к микроскопу) и функцию многопозиционной съемки, доступную в программном обеспечении для визуализации. Вручную установите положение каждой куколки в программном обеспечении с помощью ручек управления положением на сцене, а затем вручную установите соответствующие пределы z-стека (сверху и снизу) для каждой куколки.
8. Визуализируйте покадровые изображения во время съемки или позже с помощью специализированного программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ) с помощью проекций z-стека или 3D-рендеринга. Например, чтобы следить за движениями отдельных гемоцитов (как на рисунках 2C' и D'), отслеживайте ядра гемоцитов с помощью плагинов ImageJ "TrackMate" или "Manual Tracking" с открытым доступом (методы, опубликованные в).
9. Используйте фотоконвертируемые зонды (например, Kaede) для селективного фотоконвертации и мечения подмножества эпителиальных или иммунных клеток во время визуализации.
   1. Откройте соответствующие модули в программном обеспечении для обработки изображений для выполнения фотопреобразования (например, модуль восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и модуль восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания) и активируйте лазер с длиной волны 405 нм (щелкнув в соответствующем программном блоке).
   2. Выберите ячейки для фотоконвертации в программном обеспечении FRAP с помощью инструмента выделения квадрата, круга или от руки. В программном обеспечении FRAP установите временной ход для фотопреобразования (отбеливания) на одну итерацию/кадр и установите лазер с длиной волны 405 нм на 20% мощности лазера. Вручную нажмите кнопку Начать эксперимент, чтобы выполнить фотоконверсию.
   3. Выйдите из модуля FRAP (нажмите кнопку «Закрыть») и вернитесь к исходному экрану изображения в программном обеспечении; используйте лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм для отображения поведения фотопреобразованных и нефотопреобразованных ячеек, настроив z-стек и покадровую запись, как описано выше.
      заметка: Фотопреобразованные зонды остаются стабильными в течение многих часов после первоначального фотопреобразования, что позволяет отслеживать поведение фотопреобразованных клеток с течением времени (не менее 5 часов). Например, воспалительные клетки в ране могут быть селективно фотопреобразованы (рисунок 2F) и отслеживаться их поведение по мере их рассасывания в месте повреждения (рисунок 2G и H).

Results

Рисунок 1: Подготовка куколки дрозофилы к ранению и визуализации в реальном времени. (A) Белые куколки дрозофилы, собранные в 0 ч APF, с передним концом, обозначенным вывернутыми дыхательными придатками (дыхальцами). (B) После выращивания белых околок APF в течение 18 ч при 25 °C зрачок выглядит коричневым. Рассечение куколки должно начинаться с сам...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Акции дрозофил
вездесущий E-кадгерин с тегом GFP; ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Киотский фондовый центр, DGRC	#109007	Последовательности промоторов Ubi-p63E управляют экспрессией E-кадгерина дрозофилы (дробовик), помеченного на С-концевом конце GFP.
вездесущий E-кадгерин с тегом GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	#58742	Последовательности промоторов Ubi-p63E управляют экспрессией E-кадгерина дрозофилы (дробовик), помеченного на С-концевом конце GFP.
Вездесущий тег GFP Moesin P{sGMCA}3.1	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	#59023	Повсеместно экспрессируемый промотор/энхансер sqh стимулирует экспрессию фрагмента моэзина (который включает в себя актин-связывающие последовательности), помеченного GFPS65T.
Гемоциты, специфичные для змеи-Gal4 драйвера; srp-Gal4;	Автор: Катя Брукнер	Автор: Катя Брукнер	Экспрессия Scer\GAL4, слитого с полиА-хвостом, контролируется 2 геномными последовательностями из восходящего течения змеи дрозофилы. Источник: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Рецептор PDGF/VEGF контролирует выживаемость клеток крови у дрозофил. Ячейка разработки. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118; P{UAS-RedStinger}6	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	#8545 или #8547	Регулирующие последовательности БАС управляют экспрессией формы RFP DsRed.T4, которая помечается на С-концевом конце сигналом ядерной локализации
UAS-цитоплазматический GFP ;; P{UAS-GFP. С65Т}	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	Доступно несколько акций (например, #1522)	Экспрессия GFP версии S65T с помощью регуляторных последовательностей БАС; вариант S65T демонстрирует повышенную яркость.
UAS-photoconvertibleKaede w1118; P{UAS-Kaede.A}3	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	#26161	Белок каэде излучает ярко-зеленую флуоресценцию после синтеза, но эффективно изменяется на яркую стабильную красную флуоресценцию при облучении ультрафиолетом.
Спагетти-кабачок с тегом GFP w1118; P{sqh-GFP.RLC}	Блумингтонский центр дрозофил (Университет Индианы)	#57145	Область кодирования sqh, которая помечена на С-концевом конце тегом T:Avic\GFPS65T, экспрессируется под контролем естественного промотора sqh.
Ингредиенты для пищевых сред для мух			Пищевые среды от мух изготавливаются в соответствии со стандартными процедурами (см. Greenspan, R. 1997. Толкание мух: теория и практика генетики дрозофилы. Cold Spring Harbor Press. 1-191 стр.)
кукуруза	Wild Oats, Бристоль, Великобритания (или аналогичный поставщик)	Связаться с поставщиком напрямую	органический
Соевая мука	Wild Oats, Бристоль, Великобритания (или аналогичный поставщик)	Связаться с поставщиком напрямую	органический
Солодовый экстракт	Wild Oats, Бристоль, Великобритания (или аналогичный поставщик)	Связаться с поставщиком напрямую	органический
патока	Wild Oats, Бристоль, Великобритания (или аналогичный поставщик)	Связаться с поставщиком напрямую	органический
Агар Difco	BD Biosciences, Fisher Scientific	ДФ0142-15-2	Для приготовления корма для мух
Пропионовая кислота	сигма	402907	Для приготовления корма для мух
Нипаген	сигма	79721	Для приготовления корма для мух
Сухие хлебопекарные дрожжи	Редстар, Датчер Сайентикал, Великобритания Лтд	Редстар, Датчер Сайентикал, Великобритания Лтд	Для приготовления корма для мух
Подготовка образцов и монтаж
Парафильм	сигма	П7793-1ЭА	Для приготовления гептанового клея
Тонкая кисть из соболя	Дейлер-Роуни (или эквивалент)	#0 или 1
щипцы	Fisher Scientific (или Fine Science Tools)	NC9404145	Дюмон #5
Посуда со стеклянным дном для визуализации	МатТек	П35Г-0-10-С	Мы рекомендуем использовать чашки Петри 35 мм, с микролункой не менее 10 мм, покровным стеклом 0,085-0,13 мм, без покрытия. Чашки с более крупными микролунками позволят монтировать и визуализировать все большее количество куколок в одном эксперименте.
гептан	сигма	51730-5МЛ	Для приготовления гептанового клея
Двусторонняя липучая лента (например, скотч)	Агар Сайентифик	АГГ263	Для приготовления гептанового клея
Тюбик 50 мл (для гептанового клея)	Трубки Falcon от Fisher Scientific	Телефонный номер 14-432-22	Для приготовления гептанового клея
Предметные стекла для микроскопа	Агар Сайентифик	AGL4244	Для вскрытия куколок дрозофилы
Препарирующий стереомикроскоп со светлым полем	Leica (или аналогичная)	М50	Для вскрытия куколок дрозофилы
Микроножницы	Джон Вайс Интернэшнл	103123	Миниатюрные исследовательские ножницы (прямые)
Лазерная абляция и визуализация
Нитогенный абляционный лазер	Спектрофизика (или эквивалент Андора)	Модель VSL-337ND-S	Для ранения его следует прикрепить к широкопольной системе визуализации
Мультилазерный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (КЛСМ)	Leica (или аналогичная)	TCS AOBS SP8 или SP5-II, прикрепленный к инвертированному эпифлуоресцентному микроскопу Leica DMi8 (или аналогичному)	В идеале включает в себя моторизованный столик для многосайтового и «мозаичного» сканирования, а также «гибридные» детекторы GaAsP (которые обеспечивают гораздо большую чувствительность и усиление слабого сигнала)
Экологическая камера	Услуги по визуализации жизни (или эквивалентные)	"Система контроля температуры микроскопа"	Прикреплен к конфокальному микроскопу для контроля температуры во время визуализации
Программное обеспечение для анализа изображений
Программный модуль FRAP	Leica (или аналогичная)	Программный модуль CLSM FRAP	Для выполнения фотоконвертации фотоконвертируемых флуорофоров, таких как Kaede
ImageJ (программное обеспечение для анализа изображений)	Национальные институты здравоохранения (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Шнайдер, К.А., Расбанд, В.С., Элисейри, К.В. "NIH Image to ImageJ: 25 лет анализа изображений". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
Плагин ImageJ "Ручное отслеживание"	Национальные институты здравоохранения (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Плагин ImageJ "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Тиневез, штат Нью-Йорк; Перри, Н. и Шинделин, Д. и др. (2016), "TrackMate: открытая и расширяемая платформа для отслеживания одиночных частиц.", Методы 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (высокопроизводительное программное обеспечение для 3D-визуализации)	Перкин Элмер	Волатильность 6.3	Для анализа изображений
IMARIS (программное обеспечение для анализа изображений)	Битовая плоскость	IMARIS для клеточных биологов	Для анализа изображений