Анализ опсоно-адгезии для оценки опсонизации инкапсулированных бактерий антикапсульными антителами

Аннотация

Источник: Chua, J., et al. Анализ приверженности опсоно для оценки функциональных антител при разработке вакцины против Bacillus anthracis и других инкапсулированных патогенов. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует анализ приверженности опсоно для изучения взаимодействия между опсонизированными бактериями и иммунными клетками. Флуоресцентно меченые бактерии, обработанные тестовой сывороткой, содержащей антикапсульные антитела, инкубируют с макрофагами. После окрашивания макрофагов флуоресценцией прикрепленные бактерии на поверхности макрофагов наблюдают под микроскопом для визуализации.

Протокол

1. Бактериальная культура и препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Вид бактерий, используемый в этом протоколе, представляет собой инкапсулированный вирулентный штамм B. anthracis Ames. Все манипуляции с этим видом требуют соответствующего допуска к биобезопасности и безопасности и должны выполняться в шкафу биологической безопасности класса II или класса III, расположенном в лаборатории BSL-3. Соблюдайте организационные операционные процедуры для работы с BSL-3 и использования средств индивидуальной защиты при работе с бактериями.

1. Приготовьте бульон Brain Heart Infusion (BHI), растворив 37 г порошка BHI в 1 л воды и автоклавируя при 121 °C в течение 15 мин. Храните бульон при температуре окружающей среды.
2. Приготовьте 8% раствор гидрокарбоната натрия в воде и простерилизуйте с помощью фильтрующего шприца 0,20 мкм. Хранить раствор при температуре 4 °C и использовать в течение 1 суток.
3. Смешайте 8 г питательного бульона, 3 г дрожжевого экстракта и 15 г агара в 1 л воды, чтобы приготовить пластины с агаром NBY. Автоклав при 121 °C в течение 15 мин. Разлить в чашки Петри и дать застыть. Храните тарелки при температуре 4 °C.
   заметка: Агаровые пластины NBY могут быть изготовлены с бикарбонатом натрия или без него. Добавление бикарбоната натрия в бульон и агаровые пластины индуцирует рост мукоидных колоний, состоящих из инкапсулированных бацилл. Конечная концентрация бикарбоната натрия как в жидких, так и в твердых средах составляет 0,8%.
4. Приготовьте культуральный бульон для B. anthracis, смешав 50% автоклавный бульон BHI, 40% FBS и 10% раствор бикарбоната натрия (v/v).
   заметка: Этот бульон разработан для получения коротких цепочек инкапсулированных бацилл.
5. Приготовьте мастер-пластину B. anthracis, нанеся полосы для выделения на агаровую пластину NBY из запаса спор за день до культивирования в бульоне. Инкубировать при 37 °C.
6. Засейте 30 мл отвара культуры в вентилируемую колбу объемом 250 мл с несколькими колониями B. anthracis.
   заметка: Определенное соотношение объема к поверхности бульона, как указано здесь, необходимо для производства максимально инкапсулированных бацилл.
7. Встряхните бульонную культуру при 125 об/мин, 37 °C с 20%_CO2 и влажности в течение 18–24 ч.<бр/> заметка: Выращивание B. anthracis при температуре выше 37 °C может препятствовать образованию капсул.
8. Используйте негативное окрашивание индийскими чернилами, чтобы обеспечить достаточную инкапсуляцию и убедиться, что бациллы находятся в коротких цепочках (1–5 бацилл на цепочку) перед фиксацией (см. раздел 2).
9. Для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) последовательно разводят 100 мкл культуры 1:10 в растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) и планшетных разведениях культуры на агаровых планшетах из овечьей крови. Инкубировать в течение 12–18 ч при 37 °C. Подсчитать КОЕ и определить количество бактерий на мл культуры.
   заметка: Подсчет также может быть выполнен с помощью гемоцитометра под микроскопом после того, как бактерии зафиксированы. Однако это не рекомендуется, потому что бациллы трудно разглядеть при малом увеличении.
10. Добавьте 16% параформальдегида (ПФ) ко всему объему бактериальной культуры в конечной концентрации 4% ПФ для фиксации бацилл. Медленно перемешивать на шейкере при температуре окружающей среды в течение 7 дней.
    заметка: Семидневная инкубация в 4% PF основана на стандартной стандартной операционной процедуре Медицинского научно-исследовательского института инфекционных заболеваний армии США (USAMRIID) для фиксации вегетативных бацилл.
11. Чтобы удалить фиксатор и проверить его на стерильность, трижды промойте 4 мл (10% объема) фиксированной бактериальной суспензии в конической пробирке объемом 50 мл центрифугированием при ≥3000 x g в течение 45 мин и используя 30 мл/промывку с PBS. Храните оставшийся образец в 4% PF при температуре 4 °C.
    заметка: После гранулирования бактериальная гранула получается пушистой из-за наличия капсулы. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулы во время стирки. Необходимо удалить весь фиксатор, чтобы он не мешал тестированию на жизнеспособность. При необходимости увеличьте количество стирок.
12. Для проверки жизнеспособности инокулируйте 40 мл бактериальной среды для выращивания (например, бульона BHI) 4 мл промытой суспензии (≤ 10% от объема бульона) и инкубируйте при 37 °C в течение 7 дней. Проверьте оптическую плотность на длине волны 600 нм до и через 7 дней для измерения мутности.
13. После 7 дней инкубации в бульонной культуре насыпьте ≥100 мкл бульона на агаровую тарелку и инкубируйте еще 7 дней. Если не наблюдается увеличения мутности и роста на планшетах, исходная культура считается стерильной и может быть перенесена в лабораторию BSL-2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Федеральная программа отбора агентов требует, чтобы инактивированный B. anthracis мог быть перенесен из лабораторий BSL-3 только после демонстрации полной стерильности образца. Испытание на жизнеспособность инактивированного B. anthracis заключается в культивировании 10% образца в бульоне в течение 7 дней с последующим культивированием на твердой среде в течение еще 7 дней. Следуйте рекомендациям учреждения, чтобы получить одобрение на перевод после установления стерильности.         

2. Негативное окрашивание и световая микроскопия для наблюдения за инкапсуляцией и цепями бацилл

1. Смешайте 5 μL бактериальной суспензии с 2 μL индийских чернил на предметном стекле микроскопа. Поместите покровное стекло толщиной 1 или 1,5 мкм поверх суспензии, не образуя пузырей.
   заметка: Лак для ногтей можно использовать для приклеивания покровного стекла к предметному стеклу.
2. Наблюдайте за бактериальной суспензией с помощью объектива с масляным увеличением от 40 до 100 крат на световом микроскопе. Убедитесь, что бациллы инкапсулированы, наблюдая за зоной клиренса (капсула исключает индийские чернила), окружающей каждую бактерию, и что цепи бацилл короткие.

3. FITC-мечение бактерий

1. Растворить флуоресцеин изотиоцианат (ФИТК) в диметилсульфоксиде в концентрации 2 мг/мл.
2. Измерьте объем инактивированного бактериального запаса.
3. Промойте приклад 3 раза в PBS, чтобы удалить фиксатор.
4. Добавьте раствор FITC в конечной концентрации 75 мкг/мл. Медленно перемешивайте смесь в течение 18–24 часов при температуре 4 °C.
5. Трижды промойте бактерии путем гранулирования при ≥3000 x g, 45 мин и используя 30 мл PBS/промывку для удаления излишков FITC. Следите за тем, чтобы пушистый гранул не тревожился во время стирки. Ресуспендируйте бациллы в PBS с тем же начальным объемом.
6. Аликвотируйте и храните бациллы в микропробирках при температуре -20 °C до использования. Не замораживайте/размораживайте бациллы несколько раз, так как бациллы могут потерять свою капсулу.

4. Бактериальная опсонизация

1. Тепловой инактив небольшого объема исследуемых сывороток (от нечеловекообразных приматов, НПЧ) при температуре 56 °С в течение 30 мин в тепловом блоке.
2. Разморозьте и промойте меченые FITC бактерии с помощью PBS 2x путем гранулирования при 15000 x g в течение 3–5 мин. Повторно суспендируйте в PBS с тем же начальным объемом.
3. В 96-луночном круглом донном планшете (планшет #2) последовательно разбавляют тестовые сыворотки в клеточной среде. В другую 96-луночную круглую донную пластину (пластина #3) добавьте 10 μл разбавленной тестовой сыворотки в каждую лунку.
   заметка: В каждый планшет PBS и нормальные сыворотки обезьян включались вместо разбавленных тестовых сывороток в качестве отрицательного контроля. Мы также выбрали одну тестовую сыворотку в качестве положительного контроля для создания стандартной кривой для нормализации всех анализов, проведенных в разные дни. Положительная контрольная сыворотка была выбрана произвольно, потому что ее было много.
4. В тарелку #3 добавьте 10 μL свежевосстановленного комплемента для кроликов.
   заметка: После восстановления выбросьте оставшийся комплемент крольчат; Не замораживайте повторно и не размораживайте.
5. На пластину #3 добавьте соответствующий объем меченых FITC бацилл для кратности инфекции 1:20. Например, прибавьте объем, содержащий 5 x 10⁴ x 20 бацилл для 5 x 10⁴ ячеек. Долейте каждую лунку в пластину #3 с соответствующим объемом клеточной среды до 105 μл.<бр/> заметка: Пластина #1, содержащая клетки, получает 100 μL опсонизированных бактерий, а оставшиеся 5 μL являются объемом пустоты. Мы тестировали каждое разведение исследуемой сыворотки в двух экземплярах.
6. Инкубировать планшет #3 при 37 °C в течение 30 мин в присутствии 5%_CO2 с влажностью для опсонизации бацилл.

5.Анализ приверженности и флуоресцентное мечение клеток млекопитающих

1. Перед использованием поддерживайте температуру всех реагентов при температуре 37 °C.
2. Поместите пластину #1, содержащую адгезивные клетки, на термоблок с температурой 37 °C.
3. С помощью многоканального дозатора удалите отработанную среду из лунок и быстро замените ее на 100 мкл опсонизированных бактерий из пластины #3. Убедитесь, что во время пипетирования в лунках не образовывались пузырьки. Инкубируйте планшет #1 при температуре 37 °C с 5%_CO2 и влажности в течение 30 минут для прилипания.
4. Промойте каждую лунку 5 раз 150 μL PBS поверх нагревательного блока при температуре 37 °C, чтобы удалить неприкрепленные бациллы.
   заметка: Необходимо следить за тем, чтобы ячейки случайно не рассеялись во время стирки.
5. Разбавьте 16% PF PBS 1:4 до получения 4% PF. Закрепите ячейки 4% PF на 1 ч, добавив по 150 мкл в каждую лунку. Промойте ячейки 2 раза с PBS.
6. Смешайте 2 мкл HCS (с высоким содержанием скрининга) Orange Cell Stain в 10 мл PBS. Добавьте 150 μл этого окрашивающего раствора в неподвижные клетки и инкубируйте в течение 30 минут при температуре окружающей среды.
7. Промойте лунки 2 раза с PBS.
8. Хранить при температуре 4 °C до микроскопии.

6. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, высокопроизводительный автоматический флуоресцентный микроскоп облегчит визуализацию для OAA. Если автоматизированная система недоступна, флуоресцентные снимки адгезивных бацилл могут быть сделаны вручную. В данном исследовании адгезивные бациллы и монослои клеток визуализировались с помощью системы лазерной сканирующей микроскопии Zeiss 700 на специализированном оборудовании; Наша система состояла из инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer Z1, оснащенного автоматизированным столиком, модуля Definite Focus, объектива 40 x NA 0,6, камеры Axio Cam HRc и программного обеспечения Zen 2012 (Blue Edition). Полученные изображения являются широкоугольными, а не конфокальными изображениями. Приведенный ниже протокол предназначен для базовой настройки микроскопа, которая применима к различным автоматизированным системам микроскопии.

1. Инкубируйте планшет #1 при температуре окружающей среды в течение 30 мин. Включите микроскоп и сопутствующее оборудование.
   заметка: Акклиматизация при температуре окружающей среды предотвращает образование конденсата на стеклянной пластине во время визуализации. Кроме того, он предотвращает расфокусировку из-за температурных сдвигов.
2. Поместите пластину на сцену и сосредоточьтесь на клетках с помощью яркого поля или фазового контраста.
3. Выберите формат 96 лунок в качестве настройки пластины. Выберите настройки канала.
   заметка: Пиковое возбуждение и длина волны излучения FITC составляют 495/519 нм; окрашивание оранжевыми клетками HCS составляет 556 и 572 нм. Другие флуорофоры могут быть использованы в зависимости от фильтров, имеющихся на микроскопе.
4. Выберите настройку в режим плитки. Укажите количество изображений, которые необходимо получить.
   заметка: Функция мозаичной обработки позволяет захватывать несколько мест в лунке для отбора проб и может быть настроена на получение изображения в мозаичном или случайном формате. Мы визуализировали 10 случайных участков в каждой скважине.
5. Изменение режима сбора данных на «черно-белый» или «монохромный» и группирование ≥ 2x2,< и > заметка: Установка биннинга от 1x1 до 2x2 или 4x4 увеличит скорость микроскопии, но также приведет к снижению разрешения изображения. Для ОАА достаточно использовать эти настройки, так как в анализе перечисляются как макрофаги, так и адгезивные бактерии.
6. Включите модуль автофокусировки или фокусировки. Укажите, как часто должна выполняться функция автофокусировки. Включите функцию стека Z, если она доступна. Укажите количество стеков Z, которые будут захватывать толщину монослоя клеток и адгезивных бацилл.
   заметка: Количество выбранных стеков Z увеличит время микроскопии, но обеспечит получение изображения с правильным фокусом в каждом стеке Z.
7. Назначьте папку с файлами для сохранения изображений. Запустите программу автоматической обработки изображений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприцевой фильтр 0,20 мкм (25 мм, регенерированная целлюлоза)	Corning, Корнинг, Нью-Йорк	431222
Шприц 10 мл (наконечник Luer-Lock)	BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси	302995
15μ 96 луночных черных пластин (пластина #1 для визуализации)	In Vitro Scientific, Саннивейл, Калифорния	П96-1-Н
16% параформальдегида	Наука об электронной микроскопии, Хатфилд, Пенсильвания	15710
Колба с культурой тканей 75 см sq.	Corning, Корнинг, Нью-Йорк	430641
Агар (порошок)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	А1296
Дополнение для кролика	Cedarlane Labs, Берлингтон, Северная Каролина	КЛ3441
Экстракт бактодрожжей	BD, Спаркс, MD	No 288620
BBL Инфузия сердца для мозга (BHI)	BD, Спаркс, MD	211059
Тарелки с кровяным агаром (TSA с овечьей кровью)	Ремель, Ленекса, Канзас-Сити	Р01198
Скребок для ячеек	Сарстедт, Ньютон, Северная Каролина	83 .183
Планшеты для культивирования клеток Costar 96 лунок (планшеты #2 и 3 для разведений)	Corning, Корнинг, Нью-Йорк	No 3596
Покровное стекло	Наука об электронной микроскопии, Хатфилд, Пенсильвания	72200-10
Питательный бульон Difco	BD, Спаркс, MD	No 234000
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM), с высоким содержанием глюкозы	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	11965-092 Номер 11965-092	Содержит 4500 мг/л глюкозы, 4 мМ L-глютамина, фенол красный
Система автоматической визуализации клеток EVOS FL (флуоресцентный микроскоп)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	AMAFD1000
Фетальная бычья сыворотка	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Южный Логан, Юта	SH30071.03	Не гамма-облучение, не инактивированное теплом
Флуоресцеин изотиоцианат	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	Ф143
HCS Cell Mask Оранжевый Клеточный Краситель	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	Н32713
гемоцитометр (Улучшенный Нойбауэр)	Hausser Scientific, Хоршам, Пенсильвания	3900
Решение India Ink	BD, Спаркс, MD	261194
L-глутамин (200 мМ)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	25030081	Добавка среды с дополнительными 2 мМ L-глютамина
Nikon Eclipse TE2000-U (инвертированный составной микроскоп)	Nikon Instruments, Мелвилл, штат Нью-Йорк	ТЭ2000
PBS без кальция и магния	Лонза, Уокерсвилль, Мэриленд	17-516Ф
Пенициллин-стрептомицин раствор, 100x	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Южный Логан, Юта	SV30010
Чашки Петри (100 x 15 мм)	Фалькон, Корнинг, Дарем, Северная Каролина	351029	Для агаровых пластин
Клеточная линия макрофагов RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Манассас, Вирджиния	АТКС ТИБ-71
Слайды	VWR, Раднор, Пенсильвания	16004-422
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	С5761
Трипановый синий раствор (0.4%)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	Т8154
Zeiss 700 Лазерная сканирующая микроскопия (конфокальный микроскоп)	Carl Zeiss Microimaging, Торнвуд, Нью-Йорк	4.109Э+15